本文选择与肿瘤转移密切相关的糖脂和糖蛋白糖链(主要在O．糖链，也可在N．糖链)末端的Lewis抗原的岩藻糖基转移酶进行研究。Lewis抗原有唾液酸化和非唾液酸化两大类，而αl，3岩藻糖基转移酶-VII(FUT7)是一种终末糖基转移酶，仅催化唾液酸化的Lewis抗原岩藻糖基化生成SLex，使糖链的加工终止，糖链的结构不再改变。 细胞凋亡是多基因严格控制的细胞程序性死亡过程。已经发现许多临床疾病与细胞凋亡密切相关，如肿瘤、自身免疫性疾病、神经退行性病变等。肿瘤的发生一方面是由于细胞周期发生紊乱，细胞分裂失控，引起细胞恶性增殖；另一方面，细胞凋亡不足也是原因之一。细胞凋亡异常在大多数恶性肿瘤的发病学上占有重要地位，此外，凋亡调控机制失常导致凋亡受阻对于肿瘤转移也是十分重要的。 本文采用质粒转染细胞的方法在低表达FUT7的H7721人肝癌细胞和人肺巨细胞癌95C细胞中过表达FUT7，研究FUT7转染细胞后能否引起细胞凋亡以及肿瘤细胞转移表型等方面的改变。 全文分下列三个部分： 第一部分FUT7在UVC照射诱导117721人肝癌细胞凋亡过程中的变化 1．建立UVC照射诱导H7721细胞凋亡的模型。UVC照射是一种常用的DNA损伤及细胞凋亡诱导手段，在本实验中采用的UVC照射能成功地诱导H7721细胞凋亡。中剂量(10mJ／cm2)UVC照射H7721细胞后，继续培养12h，可检测到显著的细胞凋亡的发生，细胞存活率的降低。 2．UVC照射对H7721细胞中FUT7mRNA表达的影响。采用半定量RT-PCR检测H7721细胞凋亡过程中FUT7mRNA水平的变化，发现FUT7mRNA水平在UVC照射后12h及24h显著上升。 3．UVC照射对H7721细胞表面SLex表达的影响。采用流式细胞仪检测H7721细胞凋亡过程中细胞表面的SLex表达水平的变化，发现SLex在UVC照射后12h及24h也有所增加。 以上的这些结果显示FUT7在UVC诱导的细胞凋亡过程中受到相关信号转导途径改变的影响而出现基因表达增加，本部分虽然没有检测可能受影响的信号转导网络，但是有理由推测FUT7对肿瘤细胞的凋亡有一定的促进或抵抗的作用。 第二部分FUT7通过影响MAPK通路调节UVC照射诱导的细胞凋亡 前一部分的结果显示UVC照射诱导H7721细胞凋亡过程中FUT7的mRNA水平及其产物SLex的表达水平上升，提示FUT7可能参与调节UVC照射诱导的细胞凋亡。本部分研究中，我们研究了FUT7过表达对UVC照射诱导的H7721细胞凋亡的影响，并初步探讨了FUT7发挥抗凋亡作用的分子机制。结果如下：1．成功构建了pcDNA3-FUT7质粒，转染并筛选获得稳定表达FUT7的细胞克隆，RT-PCR、免疫荧光及流式细胞检测均证实过表达成功。 2．UVC照射诱导细胞凋亡，无论是DAPI染色还是Caspase3免疫印迹结果均显示FUT7过表达细胞的凋亡水平低于转染空载体的细胞，说明FUT7在UVC照射诱导的H772l细胞凋亡过程中具有抗凋亡作用。 3．UVC照射细胞后，JNKl／2与p38-MAPK均迅速发生磷酸化，与转染空载体的细胞相比，FUT7过表达细胞中p38-MAPK磷酸化水平高2至3倍，而JNKl／2的磷酸化水平仅略高一些。尽管正常情况下，FUT7过表达细胞中的ERKl／2磷酸化水平高于转染空载体的细胞，UVC照射后两株细胞中ERKl／2磷酸化水平均显著增强但无差别。 4．采用p38-MAPK特异性抑制剂SB203580预处理H7721细胞1小时，前述UVC照射引起的p38-MAPK磷酸化被抑制，同时细胞的凋亡水平增高。再用SB203580预处理FUT7过表达及转染空载体的细胞，两株细胞中UVC照射激活的p38-MAPK磷酸大部分被抑制，同时细胞凋亡水平增高，并且FUT7过表达细胞增加的更多。 以上结果显示FUT7在UVC照射诱导H772l细胞凋亡过程中发挥抗凋亡作用。ERKl／2，JNKl／2及p38-MAPK信号转导均参与UVC照射诱导的细胞凋亡，其中以p38-MAPK最有可能涉及FUT7介导的抗凋亡效应。因为抑制p38-MAPK磷酸化能够增加细胞对凋亡的敏感性。与此一致，抑制p38-MAPK磷酸化减少FUT7过表达细胞及转染空载体细胞之间细胞凋亡程度的差异，说明FUT7至少部分通过增强p38-MAPK信号通路来发挥其抗凋亡作用。 第三部分FUT7与人肺巨细胞癌95C细胞侵袭转移的关系 FUT7可以通过调节Selectin等黏附分子来影响细胞的黏附、迁移等，本部分研究中，我们通过在低转移的人巨细胞肺癌95C细胞中瞬时过表达FUT7，研究FUT7对细胞体外侵袭能力与黏附能力的影响，并初步探索其发挥作用的分子机制。 1．在95C细胞中瞬时转染过表达野生型与突变体FUT7，RT-PCR证实过表达成功，细胞免疫荧光证实野生型FUT7才有强的合成SLex的能力，而突变体FUT7仅有微弱活性。 2．过表达野生型或突变体FUT7均能增强95C细胞的体外侵袭能力与对Fibronectin的黏附能力。 3．过表达野生型或突变体FUT7均能显著上调95C细胞中的Integrin亚基α5和β1的表达。 实验结果证实FUT7可以提高95C细胞的体外侵袭能力与对Fibronectin的黏附能力，并且这种作用不依赖于FUT7的岩藻糖基转移酶活性，而是通过某些未知途径上调Integrin亚基α5和βl的表达来实现的。 我们的研究首次发现FUT7涉及UVC照射诱导的H7721细胞凋亡：1，UVC照射可以上调FUT7的mRNA及产物SLex：2，FUT7在UVC照射诱导的细胞凋亡中起着抗凋亡作用。并且这种作用至少部分的通过增强p38-MAPK信号通路来实现。3，我们还发现FUT7能通过一种不依赖其基转移酶活性的方式调节肿瘤细胞的体外侵袭能力与对Fibronectin的黏附能力，这种作用可能部分的通过上调Integrin亚基的表达来实现的。这些研究结果拓展了我们对FUT7生物学功能的认识，也增加了我们对肿瘤细胞凋亡与转移的分子机制的理解。