目的Amadillo连环蛋白家族中的P120连环蛋白(p120-catenin,p120ctn)在胞膜与E-钙(E-cadherin)结合可以调节钙粘素的粘附力和稳定性,在胞浆通过与小RhoGTPase的相互作用调节着细胞骨架的重构。近年来,大量研究表明p120ctn还穿梭于核浆,在核内解除转录抑制因子Kaiso蛋白对其下游候选靶基因matrilysin(MMP-7)、MTA2等的转录抑制作用.已有大量的文献报道了p120ctn的磷酸化状态对E-cadherin和RhoGTPase的稳定性有明显的调节作用,而核内的p120ctn的磷酸化状态对其功能具有什么样的影响,尚无文献报道。有研究表明p120ctn通过其入核定位信号(nuclear localization signal,NLS)和出核信号(nuclear export signal,NES)进出核,而Kaiso仅发现了一个入核定位信号NLS,尚未发现其出核信号NES。有研究发现Kaiso无论在细胞浆,还是在细胞核的定位总是有p120ctn相伴随。P120ctn的丝氨基酸288位的磷酸化(Phosphorylated serine 288,Ps288)又常常出现在核内,因此我们猜想p120Ctn在核内的磷酸化状态可能影响了与Kaiso的结合,Kaiso很可能是以与p120ctn结合的形式被带出核的。我们在A549、H460等细胞系,通过转染p120ctn相关质粒,并分别加入经典的出核途径抑制剂以阻止p120ctn的出核；加入相关药物用以改变p120ctn蛋白分子上丝、苏氨酸的磷酸化状态,分别观察了p120ctn和Kaiso蛋白的核、浆分布,探讨了p120Ctn核定位和磷酸化状态对与Kaiso结合能力.Kaiso下游基因的转录以及细胞侵袭能力的影响。方法1、细胞培养及处置所用的肺癌细胞系BE1和LH7为来自于PG肺大细胞癌细胞系(北京医科大学陈杰教授馈赠)；肺大细胞癌NCI-H460、NCI-H661,肺腺癌LTEP-a-2、SPC-A-1,肺鳞癌SK-MES-1,肺小细胞癌NCI-H446细胞系均购于中国科学院上海细胞库；HBE为人永生化的正常支气管上皮和肺腺癌细胞系A549购于美国。在37度无菌环境、10%的胎牛血清,5%的二氧化碳的孵箱中培养。细胞的血清饥饿用含0.1%的DMEM,饥饿16小时；血清恢复用10%DMEM,恢复30分钟；莱普霉素B处置剂量50nM,时间为18小时；PMA应用剂量200nM,作用时间为30分钟；BisI的施用剂量为1uM,时间为10分钟。2、质粒构建和转染Mp120-1A、mp120-3A模板由美国Vanderbilt大学细胞生物学教研室构建的,由Reynolds B.Albert教授馈赠。P120-NLS-1A、3A质粒为在mp120-1A、3A的基础上构建的强制入核质粒,用PCR的方法扩增了原质粒中的P120-1A、3A全长基因,酶切PCR产物及载体质粒pCMV/myc/nuc/GFP,将全长基因连接到pCMV/myc/nuc/GFP载体相应的酶切位点上。提取质粒并送大连TaKaRa生物公司测序。pBluescript-Kaiso质粒是由加拿大Mcmaster大学生物学教研部门构建,由Juliet M.Daniel教授馈赠。由TaKaRa生物公司合成的人类P120总siRNA序列如下：A:5’-GGATCACAGTCACCTTCTA-3’; 5’-TAGAAGGTGACTGTGATCC-3B:5’-GCACTTGTATTACAGACAA-3’; 5’-TTGTCTGTAATACAAGTGC-3’C:5’-GGATAACAAGATTGCCATA-3’; 5’-TATGGCAATCTTGTTATCC-3’用转染试剂Lipofectamine 2000参照操作说明书完成瞬时及稳定转染细胞系构建。3、免疫荧光转染24小时后,转染的细胞经过固定、打孔、封闭后加入P120鼠单抗(1：200),Kaiso羊多抗(1：100),Kaiso鼠单抗(1：200),Ps288鼠单抗(1：200),湿盒中4度中孵育过夜。一抗孵育完毕,于暗室中加入二抗,抗鼠二抗FITC (1:100)、抗羊二抗TRITC (1:100)、Hoechst (1:200).最后用荧光显微镜观察并照相。4、核浆蛋白的分离、免疫共沉淀和Western-blot参照核浆蛋白试剂盒操作说明书进行核浆蛋白抽提。总蛋白及核浆抽提的蛋白用Bradford法测其浓度。免疫共沉淀的总蛋白经过加入诱饵抗体孵育、Protein G microbeads孵育后,分离并收集其免疫复合物。样本可以进行SDS-PAGE电泳,将蛋白转印到PVDF膜上。5%的脱脂奶粉或5%的BSA摇床上封闭后,加入一抗p120单抗(1：800),Ps288单抗(1：500),kaiso单抗(1：400),内参Actin (1:400), LaminB1 (1:400), Tubulin (1:200),4度孵育过夜。取出孵育后的膜用相应二抗(1：4000-1：8000)室温孵育2小时后于暗室进行ECL显色。5、RNA提取和反转录多聚酶链反应(reverse transcriptase polymerase chain reaction, RT-PCR)用TRIzol Reagent提取细胞总的RNA。用RNA PCR试剂盒依照说明书进行目的片段的扩增。用1.5%的琼脂糖胶并加入了0.1ug/ul的溴化乙腚电泳。相对RNA的量是用目的条带与P-actin的条带相比得出的值。6、Transwell基质胶细胞侵袭试验用无血清的培养基将Matrigel以1：5稀释后加入到孔径为8.0um的tranwell小室中,向小室的上室中加入100ul的细胞悬液(5×105 cells/ml),下室中加入含10%FBS的血清作为趋化诱导剂,孵箱中孵育48小时后取出,用无菌的棉签擦拭去上室的胶,滤膜经固定、染色后封片,镜检10个高倍视野(400×)7、统计分析每个试验验证了三次,所有组别之间的统计分析用的是SPSS11.5,Western-blot和RT-PCR的灰度值分析用的是方差分析LSD检验,当P<0.05认为差异有统计学意义。实验结果1、Western-blot结果显示：肺癌细胞及正常支气管上皮HBE仅表达p120ctn1、3亚型；核浆蛋白抽提后发现：相应细胞核浆中均有二个亚型的表达；免疫共沉淀发现：仅p120ctn3亚型可以沉降下来Kaiso, p120ctn 1亚型却未能成功沉降Kaiso。2、核浆蛋白抽提后Western-blot结果显示：过表达p120ctn3亚型(p120-3A)后,与空转染组相比出现了细胞浆中Kaiso的量增加(P<0.05),细胞核中的量减少(P<0.05)的现象；而过表达p120ctn 1亚型(p120-1A)Kaiso的核浆表达量与空转染组相比没有明显变化(P>0.05)。3、施加莱普霉素后核浆蛋白抽提、Western-blot的结果显示：施加莱普霉素的过表达p120-3A与未施加的相比,部分p120ctn 3亚型被阻滞于细胞核内(P<0.05),同时Kaiso的核浆再分布也被终止。莱普霉素也同样阻滞了部分p120-1A的出核,但对于Kaiso的核浆分布没有影响。4、RT-PCR结果显示：过表达Kaiso后,Kaiso下游候选靶基因MMP-7和MTA2明显下调(P<0.05)；过表达p120-1A和p120-3A均上调了MMP-7和MTA2的mRNA水平(P<0.05),但过表达p120ctn 1亚型上调的程度强于过表达p120Ctn3亚型。5、应用饥饿诱导,PMA及其抑制剂BisⅠ处理细胞后核浆蛋白抽提、Western-blot检测结果显示：p120ctn 3亚型的丝氨基酸的288位点饥饿诱导磷酸化后增强了与Kaiso蛋白的结合,并增强Kaiso的出核量,同时增强上调MMP-7和MTA2的mRNA水平；PMA诱导288位点的去磷酸化可以逆转上述作用。6、免疫荧光F-actin染色和基质胶侵袭transwell实验结果显示：p120蛋白的入核和丝苏氨基酸位点的磷酸化均可以促进肺癌细胞伸出伪足和形成侵袭边缘,磷酸化后穿入transwell小室的癌细胞明显增多(P<0.05)。结果1、核浆穿梭的p120Ctn 3亚型与核浆穿梭的Kaiso直接结合2、核浆穿梭的p120ctn 3亚型协助Kaiso出核3、p120ctn的NES序列具有引导Kaiso蛋白出核的功效4、p120ctn 1、3亚型均具有解除Kaiso对下游靶基因的抑制作用5、P120ctn蛋白丝氨基酸288位点的磷酸化调控着Kaiso蛋白的亚细胞定位和Kaiso介导的转录抑制作用6、P120ctn丝苏氨基酸位点的磷酸化促进肺癌细胞的侵袭