论文部分内容阅读
前言 1型糖尿病是由胰岛β细胞自身免疫损伤导致胰岛素绝对缺乏的一种代谢障碍性疾病，目前临床上主要采用胰岛素替代疗法。随着分子生物学和细胞生物学的发展，人们开始把研究重点放在1型糖尿病的基因治疗上。通过基因转移技术将突变人胰岛素原基因直接导入糖尿病病人体内，使其能在病人肝细胞染色体中稳定整合并且能按生理模式分泌出成熟胰岛素，最终可达到永久治疗1型糖尿病的目的。 本实验用包装细胞对突变人胰岛素原基因与逆转录病毒重组后产生的质粒进行包装并测定病毒滴度。由于逆转录病毒载体(PLXSN)本身是由Moloney小鼠白血病病毒改建而成，在改建中其gsg、env、pol三部分编码野生型病毒颗粒所必需的基因被去除，无法编码病毒结构蛋白，而包装细胞则是已经人为导入了表达病毒结构蛋白基因的细胞系，故载体需要经过包装细胞的反式补偿才能装配成病毒颗粒。本实验所用包装细胞PA317是第二代包装细胞，其产生的逆转录病毒可感染多种动物，具有广谱的宿主范围，而且还具有高病毒滴度，不产生辅助病毒的特点，适用于人类基因治疗的实验研究。 本实验的目的是： 1．掌握细胞培养及冻存技术。 2．掌握基因转染技术及鉴定方法。 3．筛选出高滴度的产病毒细胞克隆，为糖尿病基因治疗的进一步实验奠定基础。 材料与方法 H材料 PLXSN质粒购自美国CLONTECH公司。PLXSN－MpINS质粒是由前一步实验人员将MpINS质粒与PIHSN重组构建而成。PA317包装细胞购自中国科学院上海细胞库。NIH3Th细胞系由本室提供。脂质体（LIPOFECTAMINEm）购自美国 M TeCImolo－gies公司。cafs（Geneticin）、DMEM（D讪既co’s mo沥ea E呼e’smedium）培养基均购自北京华美公司。PCR试剂购自中日合资宝生物工程（大连）有限公司。25Inl培养瓶和6孔培养板购自北京华美公司。 一方法 1．用碱裂解法提取含突变人胰岛素原基因的质粒。 2．应用脂质体载体介导方法将PLXSN－MpINS质粒转染至PA317包装细胞。 门转染前24小时，将对数生长期的PA317细胞按4rllir孔加人6孔培养板，并用单无 DMEM培养液将细胞配成 10’细Mud浓度。 2）转染当天，按脂质体试剂操作说明书的优化组合条件进行实验，将PLXSN－MPffiS质粒转染至PA3 17细胞，并将未转染的PA317细胞设为对照组。 3．用G418筛选出阳性产病毒细胞克隆并测定病毒滴度。 4．用1’mrOL法提取末转染和转染后PA3 17细胞的基因组DNA。 ·2· 5．采用PCR检测突变人胰岛素原基因的整合情况以证明所产生的病毒DNA没有发生重排或丢失。 实验结果 1．PA317抗性克隆的形成。 经脂质体介导将PLXSN－MpINS导人PA317细胞并用G418筛选可得到大小不等的细胞克隆（图门，而对照组无细胞克隆形成且绝大部颁亡（图2人说明基因转导已经成功。 此后逐渐将长大的抗性克隆局部消化并转移到6孔板，再传至 25 Inl培养瓶内。 收集PLXSN－MpINS－PA317的培养上清用以转导NIH3Th细胞。 2．病毒滴度的测定 挑选出7个克隆按病毒滴度计算公式计算得到下表： 表 IPA3 17的病毒滴度＊fu／Inl） 克隆 病毒滴度＊） l 二．80 X 104 ZI．23X104 31．15 X 104 4 二．44X10’ 5 9．72 X 103 61．93 X 104 7 2．10 X 104 ·3· 3．目的基因整合的鉴定 用PCR扩增及电泳鉴定突变人胰岛素原基因的整合情况：发现阳性克隆细胞基因组都扩增出418hp的目的基因片段电泳条带，而未转基因的PA317细胞DNA则无此条带（图3入证明突变人胰岛素原基因已在 PA3 17细胞基因组上稳定整合。 讨 论 脂质体转染法的原理是：脂质体通过和样品中DNA相互作用，形成脂质体－DNA复合物。这种脂质体一DNA复合物可以吸附于靶细胞表面，通过脂质体膜与细胞膜融合而将外源DNA导人纲胞内。脂质体转染法操作方便、毒性低、转染效率可靠、既适用于瞬时转染也适用于稳定转染。但脂质体转染法存在一个主要缺点即转人的基因不能稳定长期表达。为了克服这一不足，我们使用逆转录病毒载体来介导，将构建于逆转录病毒载体上的突变人胰岛素原基因通过脂质体转染到靶细胞。逆转录病毒载体除了具有可转染的靶细胞种类多，转染效率高等优点外，还可整合至靶细胞染色体中，进行复制转录，从而得到稳定表达。 将目的基因导人靶细胞是基因治疗过程中的一个重要环节，其效率的高低将直接影响基因治疗的效果甚至成败。而逆转录病毒载体介导的基因转移中高滴度感染性逆转录病毒包装细胞系的获得对目的基因转?