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目的:神经细胞的生物学行为包括细胞的增殖分化凋亡等生长形态方面的行为及细胞功能性的行为。细胞的生物学行为除了受基因调控作用,还受到多种细胞因子和细胞外环境(如PH值、ECM,各型胶原,化学介质,糖蛋白,脂肪酸,多肽等)的影响。本实验以转化生长因子-β1(TGF-β1)对体外培养的大鼠神经干细胞(NSCs)生长形态生物行为即增殖、分化及凋亡的影响以及酸中毒下GABA能神经元的功能损伤作用为例,着重研究了细胞因子和细胞外环境对神经细胞生长形态方面及功能方面的生物学行为的影响。
方法:1、TGF-β1对体外培养的大鼠NSCs生长形态生物行为即增殖、分化及凋亡的影响:体外培养大鼠NSCs,通过细胞形态观察、MTT法、免疫荧光法等探讨TGF-β1不同浓度下对大鼠NSCs增殖分化的影响TUNEL原位细胞凋亡检测法检测TGF-β1对细胞凋亡的影响。2、酸中毒对GABA能神经元功能的损伤作用:选用出生后17-22天的FVB-Tg(Gad GFP)4570Swn/J小鼠制作模拟酸中毒脑片,在488 nm的激发波长下,利用荧光显微镜选择GFP标记的感觉皮层中Ⅱ-Ⅲ层的GABA能神经元,采用全细胞膜片钳方法,测定PH从7.35到6.7时,Vts(阈电位),ARP(不应期),ISI(放电间隔)和EPSC(兴奋性突触后电流)和SEPSC(自发性兴奋性突触后电流),比较这些数据在酸中毒前后的标准差,通过t检验,研究探讨酸中毒对GABA能神经元电生理功能的损伤作用。
结果:1、TGF-β1对体外培养的大鼠NSCs生长形态生物学行为即增殖、分化及凋亡的影响:分离培养的大鼠NSCs表现为nestin免疫染色阳性,具有自我增殖能力、且能分化为神经元和星形胶质细胞;在2-4 ug/l浓度下TGF-β1能显著促进NPCs的增殖,具有峰值效应,能显著增大神经球直径及促进神经球内增殖;TGF-β1能显著促进NSCs分化速度及贴壁分化率,分化细胞更多,细胞分布较对照组更加浓密,其分化细胞的突起细而且长,互相之间的联系也更为紧密。采用免疫荧光技术对TGF-β1干预后的NSCs分化细胞进行神经元和星形胶质细胞特异性蛋白进行染色,发现虽然分化为神经元的细胞比例与对照组无明显差异,但TGF-β1却可以提高星形胶质细胞的分化。在此浓度下TGF-β1还能显著减少NSCs的凋亡率。2、酸中毒对GABA能神经元功能的损伤作用:酸中毒下GABA能神经元接收兴奋性突触传入和编码发放动作电位的能力减弱。在体外模拟酸中毒,利用全细胞电压钳技术测定PH从7.35到6.7时,Vts,ARP,ISI,EPSC,SEPSC,比较这些数据在酸中毒前后的差异。统计学分析显示,与对照组相比,酸中毒显著抑制EPSC(P<0.01,n=12),且降低SEPSC的振幅和频率,这一结果表明酸中毒损害了皮质GABA能细胞的受体反应性和突触活性,从而损害皮质GABA能神经元的兴奋性。酸中毒通过电压门控钠通道损害了编码动作电位的能力。动作电位通过在皮质GABA能神经元导入去极化脉冲(200ms)来诱发。ISI通常被用来代表发放动作电位的能力。本实验证实,酸中毒组与对照组相比,ISI存在显著差异(P<0.01,n=15)。动作电位取决于不应期和电压门控钠通道介导的阈电位,统计学分析表明,酸中毒与正常对照情况下相比,Vts显著抬高(P<0.01,n=15)而ARP显著延长(P<0.01,n=15),因而损害了皮质GABA能神经元细胞编码发放动作电位的能力。
结论:1、TGF-β1对NSCs的增殖与分化均有一定的促进作用,且对NSCs的诱导凋亡具有保护作用,因而对NSCs生长形态方面的生物学行为存在影响。2、酸中毒条件下可减弱皮层GABA能神经元接收兴奋性突触传入和编码发放动作电位的能力,说明细胞外环境中PH值对神经细胞的功能性生物学行为存在影响。