第一部分SGK1在耐药性癫痫患者和点燃大鼠脑组织中的表达及其机制目的:有研究证实血清-糖皮质激素诱导蛋白激酶1(SGK1)能通过调节谷氨酸受体及转运体参与神经系统疾病中神经元兴奋性调节。我们前期通过表达谱芯片的研究发现,在耐药性癫痫患者脑组织中SGK1基因的表达较对照组高2倍以上。本研究拟通过扩大样本含量,在耐药性癫痫患者手术切除的前颞叶皮质中验证表达谱芯片结果,并探讨SGK1在点燃大鼠脑组织中的时空表达及对谷氨酸转运体的作用,了解SGK1在耐药性癫痫中的可能机制。方法:从课题组建立的脑组织库中,抽取30例耐药性癫痫患者手术切除的前颞叶新皮质,用逆转录PCR检测SGK1基因mRNA表达,免疫组化、免疫荧光及western blot检测SGK1蛋白表达部位及水平;同步建立氯化锂-匹罗卡品化学点燃大鼠模型,用相同方法检测急性期、潜伏期和慢性期各个时间点SGK1和谷氨酸转运体3(EAAT3)蛋白表达情况;利用慢病毒SGK1-siRNA行大鼠海马注射后,检测SGK1抑制后EAAT3蛋白水平的改变,并与对照组进行比较。结果:耐药性癫痫患者脑组织中SGK1在mRNA和蛋白水平的表达均较对照组增高;动物模型中各个时间点SGK1表达也较对照组高,24h达高峰;SGK1主要在神经元胞浆表达,并与EAAT3共表达,SGK1的表达变化趋势与EAAT3接近;SGK1-siRNA抑制SGK1后,EAAT3表达降低。结论:耐药性癫痫患者和点燃大鼠脑组织中SGK1表达上调,提示其可能参与了耐药性癫痫的发生发展;动物实验证实SGK1可以作用于谷氨酸转运体,可减少癫痫发作后的神经兴奋毒性,参与神经元兴奋性的调节。第二部分癫痫患者脑脊液、血清中ApoE和tetranectin蛋白水平检测目的:课题组在前期耐药性癫痫患者脑脊液蛋白组学研究中发现载脂蛋白E(ApoE)和四连接素(tetranectin, TN)仅在癫痫患者脑脊液中存在,而对照组没检测到。为验证其可靠性,我们拟扩大样本在癫痫患者脑脊液中进行ApoE及TN的检测,同时检测癫痫患者血清中TN浓度,为临床上寻找癫痫生物标记物提供实验依据。方法:利用酶联免疫吸附法(ELISA)检测60例癫痫患者脑脊液和28例无神经系统疾病的对照者脑脊液中ApoE浓度;用相同方法检测64例癫痫患者和26例无神经系统疾病的对照者脑脊液和血清中的TN浓度。结果:①癫痫患者和对照组脑脊液中ApoE的浓度分别为5.78±2.15 mg/l和13.60±12.11 mg/l,差异有统计学意义(p<0.05);癫痫组中男性和女性患者脑脊液中ApoE浓度分别为6.53±2.55 mg/l和4.98±1.21 mg/l,差异有统计学意义(p<0.05);继发和隐源性癫痫患者脑脊液中ApoE浓度分别为5.06±1.31 mg/l和6.04±2.34 mg/l,差异有统计学意义(p<0.05);不同发作类型患者脑脊液中ApoE的浓度有差异,复杂部分性发作、部分继发全身强直阵挛性发作、全身强直阵挛性发作和失神发作患者脑脊液ApoE浓度分别为6.62±3.13 mg/l, 5.21±1.22 mg/l, 5.00±1.09 mg/l和7.25±1.88 mg/l,差异有统计学意义(p<0.05);②癫痫患者和对照组脑脊液中TN浓度分别为0.368±0.105 mg/l和0.281±0.056 mg/l,差异有统计学意义(p<0.05),血清中TN浓度分别为6.709±1.265 mg/l和8.883±1.335 mg/l,差异有统计学意义(p<0.05);耐药性癫痫与药物治疗有效的癫痫患者比较,其血清中TN浓度降低更明显,为6.369±1.134 mg/l。结论:①癫痫发作后会引起脑脊液中ApoE浓度降低,并与性别、病因和发作类型有关,能反应发作的严重程度;②癫痫患者脑脊液中TN浓度升高,而血清中TN浓度降低,血清中的TN浓度能反应药物治疗效果,可能作为耐药性癫痫的一个生物标记物。第三部分耐药性癫痫患者脑组织中DNA甲基化调节基因的表达目的:DNA甲基化是表观遗传的一种重要机制,参与调控基因的表达。在中枢神经系统,DNA甲基化在DNA甲基转移酶的催化下参与调节神经发育、突触重塑和学习记忆过程等。有研究者发现在人类颞叶癫痫中Reelin基因启动子区DNA甲基化状态与齿状回颗粒细胞分散有关,表明DNA甲基化可能参与了癫痫的发生发展过程,但DNA甲基化在癫痫中的整体变化,以及具体的调控机制仍不清楚。在本实验中,我们研究耐药性癫痫患者脑组织中整体DNA甲基化模式,探讨DNA甲基化在癫痫中的作用。方法:利用免疫组化、免疫荧光以及免疫印记方法检测耐药性癫痫患者手术切除的前颞叶和对照组脑组织中DNA甲基转移酶1(Dnmt1)和Dnmt3a的表达;利用包含全基因组启动子区CpG岛的DNA甲基化芯片,对耐药性癫痫患者脑组织和性别、年龄、切除部位相匹配的头伤减压脑组织进行扫描,通过生物信息学处理得到两组间存在差异DNA甲基化的基因,并筛选7个候选基因利用亚硫酸盐处理后PCR产物TA克隆测序(BSP)进行甲基化特异性验证,用逆转录PCR检测相应基因的mRNA在25例耐药性癫痫患者脑组织和10例对照脑组织中的表达水平。结果:耐药性癫痫患者脑组织中Dnmt1和Dnmt3a主要在神经细胞胞核和部分神经元胞浆中表达,其表达水平明显高于对照组;甲基化芯片发现224个基因在癫痫与对照组脑组织间存在DNA甲基化差异,差异基因包括调节Rho激酶、微管形成过程以及丝裂原活化蛋白激酶(MAPK)相关基因。候选基因(ADAM15、ARID1A、TUBB2B、ATPGD1、CRMP1、HTR6和STK24)中,有3个基因(TUBB2B、ATPGD1和HTR6)的转录水平与启动子区CpG岛甲基化状态相关。在癫痫脑组织中TUBB2B和ATPGD1启动子区高甲基化,相应基因的mRNA表达水平降低;HTR6启动子区低甲基化,其mRNA表达上调,其他4个基因的表达与启动子区DNA甲基化水平无相关性。结论:我们的实验发现耐药性癫痫患者脑组织中存在DNA甲基改变,其中一些基因的表达受启动子区DNA甲基化状态的调控。DNA甲基化在癫痫的发生发展过程中扮演了重要角色。