微囊藻毒素对凡纳滨对虾细胞免疫相关基因表达水平的影响

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微囊藻毒素(Microcystin, MCs)是蓝藻水华最常见的一种藻毒素,常在高温季节发生在淡水湖泊及养殖池塘中,对生活于水体中的水生生物造成了极大的影响,对水产养殖造成了极大的危害。微囊藻毒素是一种肝毒素,主要靶器官为动物的肝脏。有研究表明在凡纳滨对虾池塘中,铜绿微囊藻等蓝藻形成优势种与虾病暴发呈正相关,对虾发病池呈现硅藻到蓝藻优势的演替。而在生产中,养殖中后期的虾池,也经常爆发蓝藻水华,导致虾类原因不明的死亡。暴露于一定浓度铜绿微囊藻的克氏原螯虾、凡纳滨对虾和罗氏沼虾幼虾存活率显著降低,外观颜色及超微结构有明显变化。凡纳滨对虾俗名南美白对虾,是当今世界养殖虾类产量最高的三大品种之一(斑节对虾P. monodon、凡纳滨对虾L. vannamei和中国对虾F.chinensis)。它具有食性杂、生长快、繁殖力强、成活率高、易于饲养且营养价值高等优点,所以深受养殖户及消费者的喜爱。但由于对虾爆发性疾病的危害使其养殖面临极高的养殖风险。虽然经过科学家、政府和企业的不懈努力下恢复了一定的养殖产量,降低了养殖风险,但对虾流行性疾病仍是悬在养殖户心头的一把利剑。因此,深入开展凡纳滨对虾免疫防御机制的相关研究,探索免疫防治新途径,对实现其健康养殖和疾病控制有重大意义。本文就目前国内外研究现状,对甲壳动物的免疫防御机制进行综述,分析了甲壳动物细胞免疫及体液免疫等免疫过程的免疫机制及其免疫相关的基因和蛋白。通过对凡纳滨对虾进行血窦注射微囊藻毒素MC-LR染毒,获取其肝胰腺及血液组织样品,采用Illumina Hiseq2500测序方法获得了凡纳滨对虾在注射微囊藻毒素前后血液及肝胰腺的转录组,从微囊藻毒素对虾类肝胰腺和血淋巴细胞免疫毒性作用着手,探讨微囊藻毒素对虾类的毒性机理。并利用流式细胞仪检测注射微囊藻毒素后的凡纳滨对虾细胞凋亡现象,探讨微囊藻毒素注射凡纳滨对虾过程中对虾肝胰腺细胞中的细胞凋亡现象。并利用激光共聚焦技术观察验证细胞凋亡现象的发生。研究结果如下:(1)在血液和肝胰腺样本中分别发现了有显著性差异表达的基因序列,经过确定其中包括血液样本中的血小板反应蛋白(thrombospondin)和细胞周期素B(cyclin B)两种基因,肝胰腺样本中的酚氧化酶原(prophenoloxidase)、胰蛋白酶(trypsin)及C型凝集素(C-type lectin)等10种基因。在转录本出现显著性表达差异结果中没有明显的细胞免疫范畴基因出现,酚氧化酶原及C型凝集素等都属于体液免疫范畴,不过在对虾免疫系统中细胞免疫和体液免疫本身就相互作用,密不可分。(2)GO显著性差异表达结果证实了在血液样本组中存在细胞粘附、细胞杀伤及细胞粘附分子结合物等细胞免疫相关基因表达。在肝胰腺样本组中没有发现明显的细胞免疫相关的GO显著差异性表达,但值得一提的是其中有不少氧化还原酶及蛋白质代谢相关的GO显著性差异表达。KEGG PATHWAY显著性差异表达结果表明,在血液样本组和肝胰腺样本组中都存在吞噬体(Phagosome)、细胞凋亡(Apoptosis)、内吞作用(Endocytosis)和细胞粘附分子(Cell adhesion molecules (CAMs))等通路。(3)流式细胞仪检测PI单染的微囊藻毒素注射凡纳滨对虾肝胰腺细胞的实验结果证明在注射微囊藻毒素后有明显的细胞凋亡现象发生,在12h内缓慢增长,12至24h增长较快,24h后这个趋势明显的放缓了。实验结果证实了在微囊藻毒素感染的情况下凡纳滨对虾细胞凋亡现象的存在,并且与注射后感染时间存在一定的关系。(5)激光共聚焦观察细胞凋亡现象的结果也证明了在微囊藻毒素感染后的凡纳滨对虾肝胰腺细胞确实发生了细胞凋亡现象。以上结果表明,凡纳滨对虾感染微囊藻毒素后多种免疫相关基因都发生了显著性差异表达,证实了细胞吞噬作用和细胞凋亡作用在对抗微囊藻毒素感染的免疫反应过程中起到了重要作用。流式细胞仪及激光共聚焦显微镜的观察也都证实了在对虾细胞中有明显的细胞凋亡现象,并且与感染时间存在一定的关系。
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