一.脐血源内皮祖细胞(cord blood derived endothelial progenitorcell,CB-EPC)的体外分离、培养及鉴定目的:探讨体外分离及扩大培养CB-EPC的方法,在本实验室建立稳定的CB-EPC培养体系。方法:以密度梯度离心法分离脐血单个核细胞(mononuclear cells,MNCs),将MNCs接种于纤连蛋白(Fibronectin,Fn)包被的培养瓶中,培养基为endothelial growth medium-2(EGM-2),其中添加recombinant human fibroblast growth factor-β(rh FGF-β),recombinant human epidermal growth factor(rh EGF),R3-insulin-like growth factor(IGF)-1,vascular endothelial growth factor(VEGF),ascorbic acid and GA-100)及10%FBS。采用贴壁培养培养72小时(hour,h)后弃未贴壁细胞的培养方式。2-3天半量换液一次并观察贴壁细胞生长状况。待细胞出现EPC形态特征并达到80%以上融合后,可传代培养。以流式细胞术检测所分离培养细胞表面CD34,CD45,CD133,CD31,KDR,及CD14抗原表达情况,鉴定是否为EPC表型。用CCK8法分析实验所选用的Passage(P)1-P5之间EPC的体外增殖能力,以成熟内皮细胞株人脐静脉内皮细胞(human umbilical veins endothelial cells,HUVECs)为对照。以Matrigel胶铺板,HUVEC为对照,分析EPC各代细胞之间体外成管能力及差异。采用Transwell小室,分析观察各代EPC细胞的迁移能力及与HUVEC迁移能力的差异。进一步通过荧光定量PCR(real time quantitative polymerase chain reaction,RT-q PCR)方法分析所培养细胞的内皮相关基因表达,确定其内皮系属性。结果:在特殊内皮系培养基的培养条件下,72h后去除未贴壁细胞继续培养,可于体外分离培养后约21-28天时出现典型EPC表现的克隆细胞团;继续培养,细胞团分裂增殖、克隆增大并逐渐融合;细胞生长速度较快,可经胰酶消化传代培养,约4-5天可传代一次,并可稳定传代约10代左右。流式细胞技术分析所分离培养细胞表面抗原的表达,和HUVECs相比,所培养EPC均不表达或极弱表达CD45(EPC vs.HUVEC,2.32%±1.56%vs.0.92%±0.77%,P=0.236)及CD14(EPC vs.HUVEC,3.44%±1.27%vs.1.29%±0.54%,P=0.054);EPC上有干祖细胞标志的CD133阳性表达(26.12%±4.56%),而HUVEC无此抗原表达(0.13%±0.11%)(P=0.001);CD31(EPC vs.HUVEC,98.82%±1.33%vs.97.90%±1.50%,P=0.472)和KDR(EPC vs.HUVEC,34.21%±6.44%vs.30.78%±5.60%,P=0.524),在脐血EPC及HUVEC上均有阳性表达,表达量相当;CD34在脐血EPC及HUVEC上均有表达,但在脐血EPC表面表达阳性率更高(EPC s.HUVEC,45.66%±6.81%vs.26.89%±4.91%,P=0.018)。以CCK8法对脐血EPC体外增殖能力分析,和HUVEC相比,脐血EPCs在体外培养第4天后增殖更为迅速,在P1,P3及P5之间,脐血EPC体外扩增趋势相当,无明显增殖差异,均较HUVEC扩增迅速。脐血EPC可于体外形成管腔样结构,成管能力较HUVEC弱,在40×镜下观察视野内脐血EPC成管数为P1,28.67±4.51个;P3,29.33±4.51个;P5,31.33±4.04个,而HUVEC为71.67±7.64个,各代脐血EPC和HUVEC成管数差异均具有统计学意义(P1 vs.HUVEC,P=0.000;P3 vs.HUVEC,P=0.000;P5 vs.HUVEC,P=0.000),而各代EPC之间成管数无明显差异(P=0.749)。在细胞迁移能力上,于×100视野下,随机计数三个不同视野,脐血EPC细胞数为P1,208.67±13.05个;P3,204.33±16.17个;P5,203.00±16.37个,而HUVEC细胞计数为71.67±3.79,两两比较有统计学意义(P1 vs.HUVEC,P=0.000;P3 vs.HUVEC,P=0.000;P5 vs.HUVEC,P=0.000),而各代之间迁移能力无统计学差异(P=0.925)。选取内皮细胞相关基因CDH5,VWF,VEGF,TIE1,TIE2,及SELE,通过RT-q PCR方法,进一步确认所培养细胞的内皮源性质,以HUVEC为对照,脐血EPC中基因转录水平CDH5增高1.64±0.32倍(P=0.025),VWF增高4.49±0.50倍(P=0.000),VEGF增高1.76±0.12倍(P=0.008),TIE1增高2.08±0.28倍(P=0.021),TIE2增高2.25±0.26倍(P=0.014),SELE增高7.34±0.61倍(P=0.000)。结论:通过体外分离脐血MNCs,以特殊培养基贴壁、黏附蛋白包被培养器皿,培养72h弃未贴壁细胞进一步培养的方法,可于培养的21-28天获得典型EPC形态表现的细胞群。经流式鉴定该细胞群非造血系细胞,并带有部分阳性的祖细胞标记区别于成熟内皮细胞,表达内皮相关基因,符合目前对EPC的表型认知。实验中所用细胞,各代表型特征、基因表达及内皮功能稳定。从脐血中分离培养的细胞具备目前所知关于EPC的大部分特点,在本实验室已建立CB-EPC的分离、有效扩增体系,可进一步应用于后续实验。二.脐血源内皮祖细胞为基质对体外扩增造血干细胞的作用及机制探究目的:探究CB-EPC在脐血造血干/祖细胞(hematopoietic stem/progenitor cell,HSPC)体外扩增中的作用。分析以CB-EPC为基质细胞,体外扩增脐血HSPC数量的有效性,干祖细胞数量及比例,并分析扩增后的脐血HSPC体内长期造血重建的作用及相应机制。为脐血HSPC体外有效扩增提供新的途径和解决方法,为克服脐血造血干细胞移植(hematiopoietic stem cell transplantation,HSCT)因有核细胞数不足的临床应用限制提供一有效途径。方法:CB-EPC为常规分离、培养。用于HSPC获取的脐血标本,其来源与EPC分离所用脐血标本非同一供体。分离脐血MNCs后,以CD34+磁珠阳性分选法,分选其中的HSPCs并以流式分析CD34+细胞阳性率。脐血HSPC与EPC直接接触共培养或以Transwell小室的间接接触共培养,以不加EPC单纯培养的HSPC为对照,培养7天后计数扩增的细胞总数,结合流式术计数CD34+细胞数,及更原始祖细胞CD34+CD38-细胞数,各系祖细胞CD34+CD33+、CD34+CD19+、CD34+CD61+细胞数。流式细胞术检测扩增后HSPC的细胞周期,分析分裂各期细胞比例。比较扩增前后脐血HSPC的集落形成能力,行HSPC扩增后的功能学分析。建立人-非肥胖糖尿病、重症联合免疫缺陷小鼠(non-obese diabetic/severe combined immunodeficient mice)NOD/SCID鼠异种移植模型,移植分组包括:经MACS后CD34+干细胞组;单纯培养7天后干细胞组;共培养7天后干细胞组及照射组;分析移植后小鼠的生存状况、外周血象的恢复及移植后的人类HSPC嵌合。以RT-q PCR方法分析EPC扩增脐血HSPC的分子机制,并取具有体外扩增HSPC作用的间充质干细胞(mesenchymal stem cell,MSC)为对照。结果:在培养7天后,直接接触共培养HSPC扩增6.75±0.84倍,单纯HSPC培养扩增3.76±0.60,二者之间存在统计学差异(P=0.003);间接接触共培养体外扩增HSPC 7.56±0.80倍,较单纯HSPC培养扩增倍数存在显著性优势(P=0.001);但直接接触共培养与间接接触共培养在HSPC的扩增倍数上,无明显差异(P=0.239)。直接接触共培养可扩增CD34+细胞5.38±0.61倍,单纯体外扩增培养有3.25±0.59倍CD34+细胞扩增,二者相比较具统计学差异(P=0.003);间接接触共培养同样可有效扩增CD34+细胞,扩增倍数为4.06±0.43倍,较单纯培养具统计学差异(P=0.025),与直接接触共培养之间无统计学差异(P=0.124),表明EPC的体外支持脐血HSPC扩增作用主要来源于细胞因子的分泌,而细胞间的直接生理性接触对HSPC扩增作用有限;在单纯培养条件下,CD34+CD38-细胞群扩增79.12±19.77倍,与EPC的直接接触共培养后,该群细胞扩增倍数可达156.17±21.32倍,明显较单纯培养时扩增倍数增高(P=0.010);在间接接触共培养条件时,该群细胞可获95.43±33.00倍扩增,亦较单纯培养时升高(P=0.026);接种0天时,脐血HSPC中CD34+CD38-的细胞比例为2.13%±0.58%,经单纯共培养7天后该比例达到44.29%±7.30%;经直接接触共培养可将该群细胞比例升高至48.38%±5.07%,与单纯培养下该细胞群比例无明显统计学差异(P=0.392);而间接接触共培养情况下CD34+CD38-群比例为24.58%±3.02%,较单纯培养(P=0.004)及直接接触共培养(P=0.002)条件下细胞比例均低;该部分结果显示,尽管EPC支持脐血HSPC体外扩增主要依靠EPC细胞因子的分泌,但是EPC与HSPC的细胞间直接接触有利于维持更原始造血细胞的比例。在直接接触共培养条件下,CD34+CD33+及CD34+CD61+细胞群较单纯培养或间接接触共培养均有更多倍数的扩增,而淋系CD33+CD19+在三种培养条件下扩增倍数相当。细胞周期结果显示,单纯培养后较培养前HSPC有G0/G1期细胞比例的下降(60.67%±1.68%,P=0.000),S期细胞比例的升高(31.40%±3.50%,P=0.000),而G2/M期细胞比例相当(5.94%±0.17%,P=0.120);经接触共培养7天后的细胞群,也存在G0/G1期比例下降(59.77%±1.94%,P=0.000),S期细胞比例上升(35.17%±2.75%,P=0.000),但有相当的G2/M期细胞比例(5.62%±0.39%,P=0.851),尽管以EPC为基质的体外共培养体系可较单纯培养提供更高倍数的HSPC扩增,却仍保证了足够的细胞处于分裂前期,有助于维持其干细胞特性;以EPC为基质共培养后的HSPC形成的CFU总数不仅比新鲜分离的HSPC多(446.33±6.66 vs.124.67±9.71,P=0.000),且比单纯培养后的HSPC总数多(446.33±6.66 vs.257.33±6.67,P=0.000)。就CFU的种类而言,与EPC共培养后的HSPC形成的各类CFU,在CFU-GM,BFU-E以及CFU-E数量上均较新鲜分离后的HSPC和单纯培养后的HSPC所形成的CFU数量多。人-NOD/SCID小鼠移植实验中,可观察到EPC扩增培养HSPC移植组与未经培养组有相似的白细胞、血红蛋白及血小板的各系血细胞恢复趋势;在移植后5周内,EPC扩增培养HSPC移植组小鼠的血红蛋白及血小板水平较未经培养HSPC组小鼠更高;单纯培养HSPC移植组小鼠多在移植后5周内死亡,未到达观察终点,未经培养HSPC组、EPC扩增培养HSPC移植组到观察终点分别有50%,60%小鼠存活,在生存时间上经统计分析无明显统计学差异(P=0.892)。在移植后8周未经培养HSPC组、EPC扩增培养HSPC移植组小鼠中均有人CD45的成功植入,平均嵌合率分别为16.0%±14.3%,13.3%±11.0%(P=0.750)。分析其机制,RT-q PCR结果显示EPC中的造血相关细胞因子基因IL6(4.24±1.42倍,P=0.017)、ANGPT1(7.75±0.90倍,P=0.000)及CXCL12(8.25±2.03倍,P=0.025)基因的转录水平均较MSC高;信号通路相关分子基因WNT5A转录水平在EPC中有明显升高(11.76±2.11倍,P=0.013);且经过体外共培养后的HSPC中,其WNT5A基因转录水平较培养前明显上调(3.49±0.54倍,P=0.001)。结论:人脐血源EPC可在体外有效扩增HSPC,提高细胞总数及具有原始造血、长期始动能力的细胞数量比例,提高各系祖细胞数量,并可保证一定数量处于静息期的HSPC数量,维持干细胞特性。经EPC为基质细胞扩增后的脐血HSPC具有良好的干细胞功能,可于体内植入及重建造血,在移植早期促进造血恢复。相关机制可能与EPC分泌多种造血相关因子及激活Wnt信号通路有关。脐血源EPC是良好的体外扩增HSPC的基质细胞,可为脐血HSPC体外有效扩增提供新的途径和解决方法。三.脐血源内皮祖细胞联合造血干细胞移植在造血重建和移植物抗宿主病中的作用初探目的:通过联合脐血源EPC及HSC共移植的方式,分析其是否可通过修复移植过程中的内皮损伤,达到促进移植后的造血重建和减轻移植物抗宿主病(graft-versus-host disease,GVHD)的作用。方法:建立人-NOD/SCID鼠共移植(EPC+HSC)模型,以单纯移植HSC小鼠为对照,观察移植后的生存状况、造血重建及体内植入,观察移植后小鼠有无GVHD相关症状并记录评分,以病理实验进行GVHD的验证;以CD31免疫组化病理实验分析共移植EPC组小鼠的骨髓微血管恢复情况,并与单纯移植小鼠比较;以慢病毒转染的方式转染绿色荧光蛋白EGFP入EPC,并建立小鼠移植模型,分析移植后EGFP-EPC的归巢及分布,是否直接参与骨髓的微血管恢复。以MSC为对照,流式细胞术分析EPC的表面人类白细胞抗原(human leukocyte antigen,HLA)抗原表达及行混合淋巴细胞实验对EPC免疫原性进行分析。结果:经单纯移植小鼠(n=10)的中位生存时间为51天,长期存活率为60%;经脐血EPC联合HSC共移植组小鼠(n=10)的中位生存时间为54天,长期存活率为70%;EPC联合HSC共移植组较单纯移植组在生存时间上有提高的趋势,但统计学比较无明显差异(P=0.314)。两移植处理组均随着时间延长有血细胞恢复趋势,在观察的各时间点可发现共移植组较单纯移植组在WBC、HBG及PLT上均恢复值高。单纯移植组骨髓中人CD45嵌合比例为(13.27%±6.36%),共移植组骨髓中人CD45比例为(18.21%±10.57%),无统计学差异(P=0.308);在单纯移植组脾脏中的嵌合比为(4.91%±7.56%),共移植组中该比例为(5.14%±2.97%),无统计学差异(P=0.840)。单纯移植组中共有3只小鼠出现GVHD症状,主要表现为体重下降和(或)弓背姿势和(或)活动度下降和(或)耸毛,评分分别为2分、2分、6分;在共移植组中共观察到2只小鼠出现GVHD症状,该组的主要表现是体重下降和(或)轻中度活动度下降,评分分别为2分,1分;存在GVHD表现的小鼠存在不同程度的小肠和骨髓损伤,主要表现为腺体轻中度破坏和或骨髓增生度减低、骨小梁连续性差。EPC共移植组小鼠在观察终点时骨髓中有明显的、连续的CD31阳性染色,骨髓血管窦结构显示完整,提示其微血管恢复良好,而经单纯移植的小鼠骨髓血管内皮细胞有部分恢复但总体骨髓微血管恢复情况较共移植组为差。在将EPC转染EGFP并行移植实验后24h,骨髓中可检测到一定的呈聚集的染色阳性细胞,平均阳性比例占所有有核细胞比约为2.3%;移植后72h及7天,仍可见少量的阳性染色细胞分布于骨髓。实验中所用的EPC的免疫原性均较低,其表面HLA-I类抗原(HLA-ABC)的阳性率为(27.97%±3.60%),MSC的HLA-I类抗原阳性率为(44.46%±7.18%)(P=0.024);EPC表面HLAⅡ类抗原(HLA-DR)的阳性率为(6.37%±2.73%),同样较MSC该类抗原(14.77%±1.96%)表达低(P=0.012);与人淋巴细胞行混合淋巴细胞实验,以CFSE染色后未发现淋巴细胞过度增殖的现象。结论:本部分实验揭示了脐血EPC联合造血干细胞移植具有一定的促进移植后造血重建、减轻GVHD、延长生存时间的趋势,但因受样本量所限,仍需进一步扩大样本量进一步验证。修复骨髓微环境的髓窦内皮细胞损伤,可能是脐血源EPC促进移植后造血重建、减轻GVHD的机制之一。