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研究背景与目的肾细胞癌(RCC)是一种常见的泌尿系统恶性肿瘤,尤其晚期患者手术后易复发和转移,而且对放射和化学抗癌药物治疗都不敏感,免疫治疗也仅仅起到一定的作用,因此病人预后差。肾癌细胞的生物学研究表明,肿瘤抑制基因VHL与肾癌的发病有关。人类VHL基因定位于染色体3p25-26区,全长约15 kb,其编码产生的VHL蛋白可以与Elongin B-C、CUL2蛋白组成VBC复合物,该复合物被证实属于E3-泛素蛋白酶(E3-ubiquitin-proteasome)系统,参与人体内多种蛋白的降解过程,进而实现对细胞因子的抑制,从而调节细胞周期并抑制细胞增殖,这是传统研究证实的VHL蛋白的一项重要功能。而本课题的基础理论则涉及到了VHL基因抑癌作用的另一个机制,即阻断肾癌细胞的增殖、转移的必需信号——胰岛素样生长因子Ⅰ(insulin-like growth factorⅠ, IGFⅠ)受体信号。VHL抑癌基因蛋白质氨基端β结构域的(104—123)的20氨基酸短肽具有VHL蛋白质一样的作用,封阻IGF受体胞浆结构域同其下游信号分子-蛋白激酶(protein kinase C 8)的相互作用,抑制了protein kinase Cδ的活化,能够抑制RCC生长,并促进其凋亡。基于这个机制及应用重组腺相关病毒载体,我们在先前的研究中已成功构建了能持续分泌表达NT4-TAT-6×His-VHLβ结构域肾癌抑制融合肽的重组腺相关病毒(rAAV/NT4-TAT-6×His-VHLβ),并通过转染体外培养的肾癌细胞株,显示出了对肾癌细胞的毒性效应,并诱导细胞产生了以凋亡方式为主的细胞死亡。目前需要我们建立合适的肾癌移植瘤模型,来研究分泌表达NT4-TAT-6×His-VHLβ的重组病毒对肾癌移植瘤的治疗效果。鸡胚绒毛尿囊膜(CAM)是由胚龄4-5d绒毛膜体壁中胚层和尿囊膜脏层中胚层融合而成,其组织学结构有三层：外胚层,位于壳膜下方,由绒毛膜上皮组成；中胚层,富含毛细血管的结缔组织；内胚层,位于尿囊,由尿囊膜内皮形成。第6-7d的CAM及其血管覆盖了整个卵黄囊表面,且随着胚龄的增加而增大,毛细血管极其丰富。再加上CAM是天然免疫缺陷宿主,并可耐受一定的温度变化,有利于检测某些对温度敏感的肿瘤细胞的生物学行为。所以,CAM模型常作为移植性肿瘤的实验模型。本项研究目的包括：(1)建立人肾癌鸡胚绒毛尿囊膜移植瘤模型并观察移植瘤的肿瘤生物学特性；(2)将分泌表达NT4-TAT-6×His-VHLβ1肾癌抑制融合肽的重组腺相关病毒作用于鸡胚移植瘤,观察其作用效果。材料与方法(1)首先将肾癌细胞株RLC-310进行复苏和培养,收集对数生长期细胞,离心并用PBS缓冲液调整细胞浓度为每30ul含细胞数量分别为1.0×106、2.0×106、4.0×106、8.0×106。在超净台上将9日龄鸡胚气室端开一直径约2cm的窗口,可以看到气室底部的气室膜,然后在气室膜中央挑一小口,注入1-2滴无菌水,使气室膜与CAM膜充分分离后轻轻去除上层的气室膜,充分暴露下层的CAM膜,然后将调整好浓度的RLC-310细胞接种到鸡胚绒毛尿囊膜上封闭窗口继续孵育。后观察移植瘤的生长、诱导血管生成及形态学情况。(2)收集对数生长期RLC-310细胞,调整浓度为4.0×106/30ul,然后选用9日龄鸡胚开窗暴露CAM,将肿瘤细胞接种到CAM上。接种后第三天,选取成瘤较好鸡胚,分为A、B、C三组,分别用rAAV/NT4-TAT-6×His-VHLβ、空病毒、PBS缓冲液进行干预,观察移植瘤生长情况,干预5天后测量各组移植瘤的大小并完整剥离肿瘤,石蜡包埋、切片,通过HE染色及免疫荧光法来比较各组的作用效果。结果(1)通过观察发现鸡胚接种细胞数量越大,成瘤率越高,并证实选用4.0×106这个浓度的细胞数接种较为合适。细胞接种后3天,可见移植瘤增大,并可见瘤体周围血管向瘤体放射状集中,至第7天达生长高峰；接种7天后观察到移植瘤的质地,组织结构等特征与人肾癌基本一致。(2)结果A组移植瘤生长速度明显慢于其它两组,移植瘤体积分别为A:43.85±16.60mm3, B:74.20±25.74mm3, C:82.35±33.96mm3, A组与另外两组相比差异具有显著性(P<0.05);HE染色观察发现A组鸡胚移植瘤生长受到明显抑制,在鸡胚上皮组织中呈散在的孤立瘤结节,说明浸润生长和向外播散能力降低；通过荧光显微镜可观察到A组荧光明亮(++),而对照组未观察到荧光(-),说明A组有NT4-TAT-6×His-VHLβ融合肽的表达。结论(1)肾癌鸡胚CAM模型成功建立,使我们能更好的研究肾癌的生物学特性,诱导血管生成及肿瘤侵袭转移机制,为探讨肾癌的治疗方法提供了一个良好的体内实验模型。(2)通过rAAV/NT4-TAT-6×His-VHLβ对肾癌鸡胚移植瘤的治疗效果说明了VHL基因的β片段治疗肾癌具有一定的可行性,为肾癌的基因治疗研究提供了一种新的途径。