第一部分探索烧伤后应激障碍患者脑灰质结构改变的磁共振研究背景与目的:创伤后应激障碍疾病是一类以包括持续性重现创伤体验、持续性回避、持续性警觉性增高、认知和情感障碍为特点的一类精神疾病,目前通过大量功能磁共振的临床研究认为,包括海马、前扣带回、杏仁核、前额叶皮层等区域的恐惧环路在PTSD发病过程中起重要作用,其他的一些脑区域包括后扣带回、颞极、颞中回、小脑、视觉皮层(舌回、距状皮层)、前运动皮层、顶叶、纹状体等在不同创伤类型的PTSD患者中也发现存在脑功能或结构的异常,表明PTSD具有复杂的发病机制及神经异质性,研究认为对于PTSD患者来说,创伤事件的性质及严重程度是发生该疾病的先决条件,不同类型的创伤事件对人脑结构和功能产生不同的影响,导致PTSD的发病机制也不尽相同,目前功能磁共振研究主要集中在重大自然灾难、战争、强奸、受虐等类型应激刺激导致的PTSD疾病,而烧伤后PTSD疾病的脑结构研究还比较少。寻找并理解烧伤后发生PTSD的病理生理学基础,不仅对于烧伤患者,甚至战争或重大灾害幸存者的康复有着极其重要的意义。材料与方法:1.受试者一般资料本:研究入选2012年12月至2015年9月期间20名烧伤后PTSD患者以及20名基本资料相匹配的正常对照者参与了本次功能磁共振研究。2.MRI扫描方法:采用西门子3.0T高场强磁共振扫描仪,8通道相控线圈。先进行常规T1/T2序列进行扫描,排除颅内一般病变,采用三维磁化准备快速梯度回波(three-dimensional magnetization prepared rapid acquisition gradient-ech,3D MP-RAGE)序列采集高分辨率3D-T1结构相。3.数据预处理和分析:运用基于MATLAB的DPARSFv2.3软件对数据进行预处理。4.数据统计:采用使用REST1.8自带统计分析软件进行数据统计,采用半高全宽为4mm,高斯平滑核进行平滑,并对处理后的结果进行统计分析。P<0.01,通过Alphasim方式进行校正,选取体素>40以上的组块才视为有差异的脑区,将结果叠加到T1结构图的模板上,采用双样本独立T检验分析实验组与对照组脑灰质结构的变化,最后用xjview 8软件直观观察结果。主要结果:VBM结果显示,和正常对照组比较,烧伤后PTSD患者灰质体积减少的区域有:右侧眶额区,左侧岛叶、左侧中央旁小叶、左侧中央后回、左侧楔叶。灰质体积增加的区域有:右侧楔前叶、左侧缘上回,右侧角回。主要结论:实验结果表明,在烧伤后PTSD患者中,脑结构特别是皮层结构会发生明显改变,证明了在PTSD早期,脑神经元即受到一定损伤,我们发现涉及前眶额叶皮层及岛叶区域的边缘系统及涉及楔前叶的默认模式网络系统可能在烧伤后PTSD发病过程中起重要作用,另外,还发现烧伤本身特点的一些脑改变,证明烧伤可能直接造成一定的脑损伤,病人出现的一系列感觉异常有一定的脑结构基础。第二部分SPS模型的建立及其实验研究背景与目的:之前的研究发现,在烧伤后PTSD早期即发现脑结构的改变,证明了神经元存在损伤的现象,但目前对PTSD中应激造成脑损伤的发病机制认识还不是很清楚,临床上对PTSD也缺乏有效的治疗手段。由于目前缺少对PTSD病人做分子病理的无创性研究手段,大多数分子实验主要在动物模型中进行。单次延长刺激模型(single prolonging stress,SPS)模型包含了束缚,游泳等一系列应激刺激,是目前国际上公认的PTSD大鼠模型的刺激方法,经受刺激的动物在行为上不仅能够使大鼠模拟PTSD病人出现的焦虑、恐惧、警觉性增高等临床症状,更重要的是这种模型糖皮质激素水平及负反馈抑制均出现明显改变,能在一定程度上模拟病人生化指标的改变。我们拟通过行为学及血液学相关指标测试,验证SPS模型的有效性,为进一步进行铁代谢研究奠定实验基础。材料与方法:1.SPS模型建立:1、束缚2h。2、温水游泳20min。3、将大鼠放置鼠笼中休息15min。4.乙醚麻醉。待大鼠苏醒后放回饲养笼中常规饲养7天。对照组无打扰饲养7天。2.高架十字实验、旷场实验观察SPS应激后实验动物行为学改变。3.酶联免疫吸附实验检测血清皮质醇浓度改变。4.免疫组织化学检测海马区域糖皮质激素受体变化。5.HE染色观察各个脑区的细胞形态学变化。主要结果:1.SPS模型组行为学指标发生明显改变。和对照组相比,单次延长刺激在高架十字实验中开放臂进入时间、开放臂进入路程、开放臂进入次数等指标明显低于对照组。在旷场实验中,中央区域活动时间、中央区域活动路程低于对照组,两者统计分析具有明显差异。2.SPS模型组血清皮质醇浓度明显高于对照。我们的结果显示,在SPS模型组血清皮质醇的浓度明显升高,约为对照组的2.1倍。3.免疫组织化学结果显示,在海马区域的GR受体变化明显,增加约为22%。4.通过HE染色发现,和对照组相比,在SPS模型组中前额叶、海马、纹状体细胞形态发生明显异常,异型性及核深染的细胞明显多于对照组。主要结论:1.通过对SPS组大鼠的行为学进行检测发现,在经历了SPS应激后大鼠的焦虑、恐惧程度增加,在行为学上能模拟PTSD的疾病状态。2.血浆糖皮质激素浓度和糖皮质激素受体发生异常是PTSD疾病的重要因素,通过对SPS模型组血清中皮质醇浓度和GR检测发现,SPS模型组皮质醇浓度明显增加,说明大鼠处于应激后状态。GR受体较对照组也明显增加,说明SPS模型的HPA轴负反馈抑制增强,在生化指标上能一定程度模拟PTSD病人的情况。3.进一步通过HE染色和电镜观察发现,三个区域脑细胞形态发生明显异常,证明了SPS应激对不同脑区会产生损伤,进一步验证了该模型的有效性。为之后铁代谢研究奠定基础。第三部分SPS模型中脑铁沉积异常及其机制的初步研究背景与目的:中枢系统功能的正常维持需要众多金属离子的参与,其中铁的作用最为突出。尽管脑铁代谢十分重要,但由于铁离子同时具有氧化毒性作用,细胞需要复杂精细的调节机制保证细胞铁含量处于平衡状态。近些年的研究表明,在大部分脑退行性疾病比如阿尔兹海默综合征(Alzheimer’s disease,AD)、帕金森(Parkinson’s disease,PD)、亨廷顿舞蹈病(Huntington’s disease)以及多发性硬化(multiple sclerosis,MS)均发现脑铁的沉积,最近的研究发现,在AD发病中,铁沉积发生早于斑块的形成,另外,由基因变异导致的神经铁蛋白病(neuroferritinopathy)的发现进一步说明铁含量的增加有可能是神经元凋亡的初始因素。细胞内铁代谢具有精密调节系统,其中最为重要的蛋白包括转铁蛋白受体1(transferrtin receptor1,Tf R1)和铁蛋白(ferritin,Fn)。Tf R1主要通过与转铁蛋白结合的内吞机制将铁转入细胞内,是细胞获取铁元素的主要途径,研究发现,在海马和基底节区的Tf R1密度较高,是AD中最容易发生退行性改变的区域。在PD疾病中,转铁蛋白受体发生改变被认为是与细胞凋亡密度相关。Fn是一类主要的铁存储蛋白,贮存有约1/3-3/4的细胞铁,也被认为是最重要的抗氧化蛋白之一。Tf R1、Fn是否参与PTSD的发病目前还不得而知。研究发现,大鼠经历精神性应激后脑铁及血清铁均会出现明显改变,铁含量增加的区域和PTSD的发病关键区域非常相似,比如海马、前额叶、纹状体区域。因此,我们假设在强烈的应激刺激后,细胞中的脑铁代谢发生明显紊乱。为了证实这个问题,我们采用了现在常用的单次延长刺激(single prolonged stress,SPS)作为PTSD的动物模型,通过对铁含量及相关蛋白检测探索铁在PTSD中的发病机制及作用。材料与方法:1.SPS模型建立:1、束缚2h。2、温水游泳20min。3、将大鼠放置鼠笼中休息15min。4.乙醚麻醉。待大鼠苏醒后放回饲养笼中常规饲养7天。对照组无打扰饲养7天。2.电感耦合等离子体发射光谱法(ICP-OES)测前额叶、海马、纹状体脑区铁元素的含量变化。3.蛋白质印迹(WB)检测前额叶、海马、纹状体等脑区Tf R1的变化。4.蛋白质印迹(WB)检测前额叶、海马、纹状体等脑区Fn的变化。5.实时荧光定量核酸扩增检测系统(Q-PCR)检测海马区域Tf R1、Fn m RNA表达变化。6.通过电镜观察海马区域的脑细胞形态改变。主要结果:1.SPS模型组在不同脑区铁含量明显增加。通过电感耦合等离子体发射光谱仪进行不同脑区的铁含量的测定发现,在海马、前额叶皮层、纹状体等区域的铁含量明显高于对照组。其中,海马区域升高约3.1倍,在前额叶区域升高约2.5倍,在纹状体升高约3.4倍。2.SPS模型组在各个脑区Tf R1发生改变。通过WB对各个脑区Tf R1进行检测发现,海马区域和前额叶皮质区域Tf R1发生明显变化,其中,在海马区域表达明显减低,而前额叶皮质区域表达水平明显增加,而在其他纹状体区域和小脑,Tf R1表达无明显统计学意义。3.SPS模型组在各个脑区Fn发生改变。通过WB对各个脑区Fn进行检测发现,海马区域和纹状体区域Fn发生明显变化,其中,在海马区域Fn表达减低,而在纹状体区域表达水平明显增加。在前额叶皮质及小脑,Fn表达未出现明显差异。4.免疫组织化学结果显示,在海马区域的Tf R1、Fn表达均出现明显变化,Tf R1减少约26.1%,Fn减少约20.6%,二者统计具有明显差异。5.SPS模型组在海马区域m RNA表达明显减低。通过Q-PCR检测海马区域Tf R1、Fn表达发现,在海马区域Tf R1、Fn表达均出现明显减低,其中Tf R1 m RNA表达减少41.6%,而Fn m RNA表达减少约87.4%。8.SPS模型组导致各区域脑细胞形态发生异常。通过电镜观察海马区域的脑细胞形态发现,SPS模型组中脑细胞出现水肿及细胞凋亡的现象。主要结论:1.通过ICP-OES检测不同脑区铁元素的含量发现,在海马、前额叶、纹状体区域脑铁含量明显高于对照组,我们的结果显示,铁含量的增加有可能通过Fenton化学反应产生氧自由基从而对这些区域的细胞产生损伤,进一步通过HE染色和电镜观察发现,三个区域脑细胞形态发生明显异常,证实了铁在应激过程中的沉积可能是神经元细胞发生损伤的重要因素。2.Tf R1和Fn是脑铁代谢调节的重要蛋白,我们通过WB及IHC的结果显示,在铁发生沉积的过程中,Tf R1和Fn也发生明显改变,其中各个脑区Tf R1和Fn出现不一致的反应,有可能反应了各个脑区在铁沉积时对其耐受性的差异。3.海马区域Tf R1m RNA、Fnm RNA的减少表明应激有可能从基因水平影响铁代谢,而两种蛋白由于具有相同的调节机制,两种基因表达同时减少有可能说明除了受到铁含量变化的影响,还有可能受到糖皮质激素等因素的影响。总之,本研究主要通过成功建立SPS模型的基础上,采用多种方法对不同脑区的铁元素、铁相关蛋白及基因表达进行测量,发现SPS应激刺激后,大鼠重要脑区铁出现沉积异常,在各个脑区的Tf R1及Fn表达出现明显差异性改变,提示在PTSD应激后,铁是其发生发展的危险因素之一,为PTSD疾病的病理解释提供了一个新的因子,在以后有可能成为新的治疗靶标。