p53诱导基因3(p53-inducible gene 3,PIG3),是p53蛋白在细胞凋亡初始时所诱导表达的基因之一。PIG3与植物氧化还原酶TED2以及哺乳动物醌氧化还原酶γ-Crystallin具有一定的同源性,其本身也具有一定的醌氧化还原酶活性,能够参与到细胞内活性氧的生成,抑制PIG3可使细胞内活性氧生成减少,细胞凋亡水平降低。PIG3还介导了GPx3诱导的细胞死亡。因此,PIG3被视为细胞前凋亡的标志分子之一。近年来的研究发现PIG3受到辐射诱导表达,在UV与辐射模拟药物(neocarzinostatin,NCS)引起的DNA损伤反应中发挥了重要作用,但其具体机制尚不明确。　　DNA依赖蛋白激酶催化亚基(DNA-dependent kinase catalytic subunit,DNA-PKcs)属于磷脂酰激醇3相关蛋白激酶(Phosphatidylinositol-3-kinase-like kinase,PIKK)超家族。该家族成员还包括ATM与ATR。DNA-PKcs的丝氨酸-苏氨酸激酶活性可磷酸化包括自身在内的多种底物,这些底物或作为信号转导子或者效应子在DNA双链断裂的非同源末端连接修复途径、V(D)J重组和端粒末端稳定性中发挥重要功能。DNA-PKcs与ATM、ATR磷酸化相同的底物模序,近年来也被发现在细胞周期检测点等其他DNA损伤反应途径中发挥关键调控作用。　　本研究在发现电离辐射对PIG3基因表达的调控作用的基础上,利用小干扰RNA(small interference RNA,siRNA)以及慢病毒介导的小发夹RNA(small hairpin RNA)瞬时敲低PIG3或构建PIG3抑制表达细胞模型,电离辐射诱发DNA损伤,观察PIG3敲低后细胞表型和DNA损伤反应的变化,发现DNA-PKcs是其参与DNA损伤反应的下游的调节分子,获得了以下主要进展:　　1)以电离辐射诱导DNA损伤,可引起PIG3表达增加,6、8Gy照射肺癌细胞系A549可明显诱导PIG3蛋白水平升高,而在淋巴母细胞瘤细胞系AHH1中,PIG3的表达随照射剂量增加而升高,具有良好的剂量相关性。表明PIG3可能在DNA损伤反应中发挥一定的功能。　　2)构建了PIG3稳定敲低及稳定过表达的细胞系,脉冲场凝胶电泳实验发现PIG3敲低后细胞修复DNA双链断裂损伤的能力下降;辐射所引起的γ-H2AX Ser139、周期检测蛋白Chk1 Ser317、Chk2 Thr68和Kap1 Ser824等多个DNA损伤反应蛋白的磷酸化水平降低或持续时间减短;辐射后细胞G2/M期阻滞时间延长。这些结果表明PIG3对DNA损伤反应以及后续损伤修复过程具有重要作用。　　3)胸腺嘧啶核苷(Thirdmine,TdR)双阻断法同步化细胞于G1/S期交界处后释放,检测细胞周期进程,PIG3敲低细胞G2/M期时相相对延长;生长曲线的结果表明PIG3敲低后细胞生长速度减慢;对同步化后的细胞进行western blot检测发现p53蛋白在PIG3敲低细胞中随释放时间而诱导,在释放12小时后达到峰值,而与对照细胞相比,cyclinB1蛋白基础水平较高,但当释放8-12小时后细胞进入G2/M期后其水平与对照细胞相当,表明敲低PIG3导致细胞内cyclinB的基础水平上升,细胞受照射后由于p53被高水平的诱导表达,由此抑制cyclinB1活性及表达,使细胞发生G2期阻滞进而引起细胞周期延长,细胞倍增时间延长;与此相一致,PIG3敲低还能够增加细胞对导致微管损伤的化疗药物紫杉醇的敏感性。　　4)本研究首次发现PIG3能够调控DNA-PKcs水平,在PIG3敲低细胞系中DNA-PKcs蛋白水平降低,同时引起ATM水平下降;同时PIG3对DNA-PKcs的启动子活性以及mRNA含量没有明显影响;在ATM缺陷细胞中敲低PIG3同样可以引起DNA-PKcs水平的下降,表明PIG3对DNA-PKcs的调控不依赖于ATM。　　5)本研究还发现PIG3敲低细胞在持续数代培养后,产生了一种对DNA-PKcs蛋白水平降低的反馈调节作用,表现为DNA-PKcs mRNA水平明显升高并伴随着蛋白水平的恢复甚至升高。与之相伴随的,PIG3敲低细胞系的DNA损伤反应缺陷得到挽救;siRNA及慢病毒shRNA敲低PIG3不同时间后发现DNA-PKcs蛋白在PIG3敲低后10-12天降低随后恢复,不同细胞DNA-PKcs降低及恢复时间存在差异。而稳定过表达PIG3的细胞系中DNA-PKcs的蛋白与mRNA水平没有明显变化。　　6)本研究对PIG3敲低后细胞基础水平cyclinB1升高的具体机制进行了进一步探索。我们发现DNA-PKcs水平的降低或活性抑制可引起cyclinB1蛋白水平升高;这种升高作用可被蛋白酶体抑制剂MG-132所消除,表明DNA-PKcs水平降低影响了cyclinB1蛋白稳定性;利用放线菌酮抑制蛋白合成,我们发现敲低DNA-PKcs或抑制其激酶活性使cyclinB1降解速度下降;以nocodazole阻断细胞于M期,发现DNA-PKcs降低或活性抑制使细胞M期退出减慢;DNA-PKcs还影响了cyclinB1泛素化水平,这种作用可能是通过调节APC/C复合物组分APC3和cdh1的水平来实现的。同时我们还发现DNA-PKcs能够与APC/C复合物的催化亚基之一APC2存在相互作用,提示DNA-PKcs也可能为CyclinB1与APC/C复合物的结合提供平台。　　本研究的创新点有:　　1、揭示了PIG3参与DNA放射损伤反应的关键机制。发现敲低PIG3引起DNA-PKcs的暂时性下调,并导致ATM水平下降及DNA损伤反应与细胞周期进程异常。　　2、揭示了细胞对DNA-PKcs下调的代偿性调控。数代培养之后,PIG3敲低细胞产生了代偿性反馈,表现为DNA-PKcsmRNA水平上升同时DNA-PKcs、ATM蛋白水平回复,DNA损伤反应缺陷被纠正。　　3、发现PIG3参与细胞周期的调控。PIG3敲低后导致了细胞内cyclinB1基础水平的升高,细胞G2-M期延长,同时发现这种作用由DNA-PKcs降低所引起,并初步揭示了DNA-PKcs在cyclinB1调节中的作用机制。DNA-PKcs可能通过与APC2相互作用,调节APC/C亚基含量等途径调控CyclinB1的泛素化降解,进而影响细胞周期进程。这些结果为深入了解PIG3在DNA损伤修复反应中的功能提供了新的视角,并初步提示了PIG3在细胞周期进程调控中的作用及机制。