【摘 要】
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羽衣甘蓝（Brassica oleracea var.acephala）作为一种二年生草本植物,在北方园林中应用广泛。叶色是决定羽衣甘蓝观赏价值的重要指标,然而目前关于羽衣甘蓝内叶呈色差异的分子机制尚不清晰。本研究以羽衣甘蓝粉叶、绿叶自交系为植物材料进行转录组测序,对候选基因进行克隆及生物信息学分析;基于CRISPR/Cas9基因组编辑技术,构建包含双靶点的敲除表达载体转化羽衣甘蓝以鉴定基因的功能
【基金项目】
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国家自然科学基金（31770739）；
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羽衣甘蓝（Brassica oleracea var.acephala）作为一种二年生草本植物,在北方园林中应用广泛。叶色是决定羽衣甘蓝观赏价值的重要指标,然而目前关于羽衣甘蓝内叶呈色差异的分子机制尚不清晰。本研究以羽衣甘蓝粉叶、绿叶自交系为植物材料进行转录组测序,对候选基因进行克隆及生物信息学分析;基于CRISPR/Cas9基因组编辑技术,构建包含双靶点的敲除表达载体转化羽衣甘蓝以鉴定基因的功能。取得如下研究结果:1.在莲座期测定了羽衣甘蓝粉叶自交系P23与绿叶自交系G02内叶的花青素含量,结果表明粉叶自交系中的花青素含量达到1.132 mg·g-1FW,而在绿叶自交系中未能检测到花青素的积累。2.通过转录组测序共鉴定到12个参与花青素代谢的差异表达基因,编码二氢黄酮醇4-还原酶的Bo DFR1基因差异表达倍数最大且在粉叶自交系中的表达水平显著高于绿叶自交系。同时还在转录组数据中发现了Bo DFR1的同源基因Bo DFR2,其也被注释为参与花青素的代谢过程。结合实时荧光定量PCR分析,选定Bo DFRs作为影响羽衣甘蓝粉、绿色叶花青素含量的候选基因。3.分别在粉叶自交系和绿叶自交系中克隆Bo DFR1和Bo DFR2的基因全长与编码区,结果表明Bo DFR1在P23和G02中基因全长分别为1579bp和1581bp,编码区分别为1158bp和1159bp;Bo DFR2在P23和G02中基因全长分别为1648bp和816bp,编码区分别为417bp和419bp。经过生物信息学分析,发现Bo DFR1和Bo DFR2都含有DFR蛋白典型结构域PLN02650,由于第二外显子上的碱基插入导致Bo DFR1和Bo DFR2基因在绿叶自交系中翻译均发生提前终止,并且使两个蛋白的功能域都发生短截。Bo DFR1和Bo DFR2蛋白均为稳定的亲水性蛋白,不含有信号肽和跨膜域。4.利用CRISPR/Cas9技术构建两个敲除表达载体,通过农杆菌介导法转化粉叶自交系P23,获得了4株敲除突变体。根据Bo DFR1和Bo DFR2敲除突变体的表型、编辑效果、花青素含量和靶基因相对表达量,明确了Bo DFR1是控制羽衣甘蓝花青素积累的关键基因,而其同源基因Bo DFR2对羽衣甘蓝的叶片呈色没有影响。本研究深入解析了DFR蛋白的功能,为今后观赏植物育种中叶色的改良奠定理论基础。
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