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本研究以龙眼(Dimocarpus longan Lour.cv.Honghezi)胚性愈伤组织为材料,克隆SERK等胚性相关基因(SERK基因、14-3-3基因和AGL15基因、LEC基因、CHI-I基因)及其启动子,并采用q-PCR分析其表达水平在龙眼体胚发生过程中的动态变化规律,以期为进一步了解SERK等胚性相关基因在龙眼体胚发生中的调控机制奠定基础。主要研究结果如下:1龙眼体胚发生过程中SERK等5个胚性相关基因及其启动子的克隆采用RT-PCR结合RACE方法和TAIR--PCR,克隆得到龙眼胚性愈伤组织SERK等5个胚性相关基因(SERK基因、14-3-3基因和AGL15基因、LEC基因、CHI-I基因)及其启动子:①龙眼胚性愈伤组织SERK基因(DlSERK1),1875bp的cDNA全长序列(登录号:FJ013227),包含一个长为1875bp的ORF;DNA扩增序列长为6009bp(登录号:HM773391.1),包含11个外显子、10个内含子,内含子的剪切位点均符合“GT-AG”规则; DlSERK1基因启动子长1349bp(登录号:HM773391)。DlSERK1基因可能存在的基础启动子区域为第1022～1071bp处,其序列为: 5/-AAGCAGAGGTTGAAAAAGAGGGAAATTTTATTTGGT GTTGCCCAGAAAGG -3/,预测的转录起始点在第1062bp处的C,含有与光响应、低温响应、干旱响应、热应激响应、厌氧响应、真菌激发子响应、生长素响应、赤霉素响应、脱落酸响应、水杨酸响应、茉莉酸甲酯响应及分生组织表达、胚乳表达、生物钟调控、玉米醇溶蛋白代谢调控相关的顺式作用调控元件。②龙眼胚性愈伤组织14-3-3基因(Dl-14-3-3),786bp的cDNA全长序列(登录号:GU573765.1),包含一个长为786bp的ORF;DNA扩增序列长为1859bp(登录号:GU573766),包含4个外显子、3个内含子,内含子的剪切位点均符合“GT-AG”规则; Dl-14-3-3基因启动子长910bp(登录号:GU573766)。Dl-14-3-3基因预测转录起始点在第736bp处的G,含有与光响应、低温响应、干旱响应、厌氧响应、真菌激发子响应、茉莉酸甲酯响应(MeJA响应)、赤霉素响应及胚乳表达、细胞周期调控、生物钟调控、玉米醇溶蛋白代谢调控相关的顺式作用调控元件。③龙眼胚性愈伤组织AGL15基因(Dl AGL15),765bp的cDNA全长序列(登录号:GU584088),包含一个长为765bp的ORF;DNA扩增序列长为2989bp(登录号:JF262162),包含8个外显子、7个内含子,内含子的剪切位点均符合“GT-AG”规则; DlAGL15基因启动子长1454bp(登录号:JF262162)。DlAGL15基因可能存在的基础启动子区域为第1178～1227 bp处,其序列为:5′-TTGCCCCGTTTATAAAATCT TTAAAAAAAGTAAACAACTTGAAAAGAAGA-3′。预测的转录起始点(TSS)在第1218bp处的G.,含有与光响应、低温响应、厌氧响应、热应激响应、防卫及胁迫响应、真菌激发子响应、赤霉素响应、乙烯响应、水扬酸响应、茉莉酸甲酯响应及胚乳表达、分生组织表达、蛋白结合元件、生物钟调控相关的顺式作用调控元件。④龙眼胚性愈伤组织LEC基因(DlLEC),803bp的cDNA全长序列(登录号:GU584089),包含一个长为669bp的ORF,并包含5’-UTR为7bp,3’-UTR为127bp,3’ poly(A)尾长19bp;DNA扩增序列长为669bp(登录号:HM773393.1),无内含子; DlLEC基因启动子长907bp(登录号:HM773393.1)。DlLEC基因可能存在的基础启动子区域为第725-775 bp处,其序列为:5′-CGTTACAAATT TTAAAGTTGGAGGAGGATGATAGGCATGCATTATCGATG -3′。预测转录起始点在第766bp处的A,含有与光响应、低温响应、热应激响应及胚乳表达、分生组织表达、蛋白结合相关的顺式作用调控元件。⑤龙眼胚性愈伤组织CHI-I基因(DlCHI-I),1125bp的cDNA全长序列(登录号:FJ040804),包含一个长为969bp的ORF,并包含3’-UTR为141bp,3’ poly(A)尾长15bp;DNA扩增序列长为1759bp(登录号:HM773392.1),包含3个外显子、2个内含子,内含子的剪切位点均符合“GT-AG”规则。Dl-CHI-I基因启动子长878bp(登录号:HM773392.1)。DlCHI-I基因可能存在的基础启动子区域为第690～739 bp处,其序列为:5/- CCACGAGACCCATAACTAACCGGTCC ATGGAAGCCATTTCTA GTGCATGC-3/。预测转录起始点在第730bp处的T,含有与光响应、低温响应、真菌激发子响应元件及胚乳表达、种子特异表达、生物钟调控、玉米醇溶蛋白代谢调控相关的顺式作用调控元件。2龙眼体胚发生过程中SERK等胚性相关基因的生物信息学分析龙眼体胚发生过程中龙眼胚性愈伤组织SERK等胚性相关基因(SERK基因、14-3-3基因和AGL15基因、LEC基因、CHI-I基因)的生物信息学分析结果表明:①DlSERK1基因,编码624个氨基酸,属亲水蛋白,含有3个跨膜结构,34个功能位点,4个结构域,无规则卷曲是其主要的二级结构,在N端前26个氨基酸是信号肽,亚细胞定位在细胞膜中,与不同植物来源的SERK1的氨基酸同源性为77%-88%;②Dl-14-3-3基因,编码261个氨基酸,属亲水蛋白,含有25个功能位点(基序),1个结构域,属于14-3-3基因超级家族,α螺旋结构是其主要的二级结构,没有信号肽,亚细胞定位在细胞质中,与不同植物来源的14-3-3的氨基酸同源性较高为73%-96%;③DlAGL15基因编码254个氨基酸,属亲水蛋白,含有15个功能位点,2个保守结构域,属于MADS II型超级家族,α螺旋结构与无规则卷曲结构是其主要的二级结构,亚细胞定位在细胞核与微体中,与不同植物来源的AGL15的同源性为67%-95%;④DlLEC基因,编码222个氨基酸,属亲水蛋白,含有1个跨膜结构,14个功能位点,1个保守结构域,属于H2A超级家族,无规则卷曲是其主要的二级结构,在N端前22个氨基酸是信号肽,亚细胞定位在细胞质与线粒体中,与不同植物来源的LEC1的同源性为35%-70%;⑤DlCHI-I基因编码322个氨基酸,属亲水蛋白,含有1个跨膜结构,有22个功能位点,含有2个结构域,属于糖苷水解酶19家族,无规则卷曲是其主要的二级结构,亚细胞定位在细胞外,与不同植物来源的CHI-I的同源性为70%-98%。3龙眼体胚发生过程中SERK等胚性相关基因的定量表达分析3.1龙眼体胚发生过程中SERK等胚性相关基因的定量表达情况①DlSERK1在龙眼体胚的8个阶段均有表达,整个变化趋势呈现出经水平翻转180度的躺倒的“了”字型,松散型胚性愈伤组织(Stage 1),子叶型胚(Stage 8)以及不完全胚性紧实结构(Stage 3)的表达量相对较高,鱼雷型胚(Stage 7)的表达量相对较低;②Dl-14-3-3在龙眼体胚的各阶段均有表达,整体转录水平的变化趋势呈不规则的“倒S”形,其中在松散型胚性愈伤组织(stage 1)和心形胚(stage6)及鱼雷形胚(stage7)相对高表达,构成2个表达高峰,而在球形胚(stage5)和子叶形胚(stage8)相对低表达,组成2个表达低谷;③DlAGL15整体转录水平的变化趋势呈现出单峰型,松散型胚性愈伤组织(Stage 1)到心形胚(Stage 6)的表达趋势以上升为主,从心形胚(Stage 6)到子叶型胚(Stage 8)AGL-15基因表达量呈逐渐降低的趋势;④DlLEC在龙眼体胚发育的不同时期表达量高低不同,呈现出单峰型,除了属龙眼体胚中期的心形胚(Stage 6)和鱼雷型胚(Stage 7)表达量相对较高,其余的6个阶段表达量相对较低;⑤DlCHI-I表达量整体的变化趋势呈字母“M”状双峰型,不完全胚性紧实结构(Stage 3)和心形胚(Stage 6)分别出现了峰值,子叶形胚(Stage 8)的表达量相对较低,是8个阶段的最低值。3.2龙眼体胚发生过程中龙眼体胚发生过程中SERK等胚性相关基因表达情况相互之间的联系本研究发现,龙眼体胚发生发育的8个阶段,SERK基因与14-3-3基因两者表达特性十分相似,均呈现出双峰形,第1个表达高峰均出现在松散型胚性愈伤组织(stage 1),只是14-3-3基因第2个表达高峰出现在体胚发育的中期阶段(心形胚Stage6-鱼雷形胚Stage7),比SERK基因早两个阶段出现,而SERK基因第2个表达高峰则出现在体胚发育的末期阶段(子叶形胚Stage8),SERK基因与14-3-3基因两者有一定的时间差。AGL15作为转录因子处于SERK1的上游,在龙眼体胚不同发育阶段中Dl-AGL-15基因的转录水平在心形胚阶段呈现表达高峰,而SERK基因在心形胚阶段之后的子叶形胚(Stage8)也出现表达高峰.总之,本研究首次在龙眼上克隆SERK等5个胚性相关基因,对其结构和功能进行了预测,研究了基因在体胚发生过程中的表达规律,并且首次在木本体胚中探讨SERK等5个胚性相关基因的互作,同时还克隆到了SERK等5个胚性相关基因启动子部分序列,有助于今后对龙眼体胚发生机制的更深入探索,也为龙眼遗传改良提供目的基因资源。