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目的：N—甲基—D—天冬氨酸受体(N-Methyl-D-Asparate Receptor, NR)广泛参与应激、脑损伤、药物成瘾、疼痛等病理生理过程。选择性阻断NR活性可能成为相关疾病的治疗手段。现有的NR拮抗剂或阻断剂均为人工合成的小分子药物,由于作用选择性低常引起幻觉、焦虑不安、意识模糊等严重毒副作用,并存在难以超早期用药的问题。NR1是NR的功能亚单位,具有NR1的一切电生理学特性和药理学活性。NR1口服疫苗可能是超早期调控机体应激、防止脑损伤、减缓药物成瘾和治疗疼痛等的可行方法之一。但需要有载体携带进入血脑屏障发挥作用,而转铁蛋白受体单克隆抗体OX-26是迄今被认为最有前途的脑转运载体,它可携带NR1抗体通过血脑屏障,从而使得NR1抗体能够在中枢神经系统发挥作用。因此,本研究旨在用噬菌体肽库展示技术模拟小鼠NR1和TFR的抗原表位,构建NR1-TfR融合蛋白真核表达载体,构建单B细胞表位疫苗。方法：(1)利用噬菌体十二肽库展示技术筛选小鼠NMDAR1单克隆抗体MAB363的抗原表位筛选(本课题前期研究已完成),筛选小鼠转铁蛋白受体单克隆抗体OX-26的抗原表位优势克隆,(2)计算机模拟表位融合免疫原性蛋白的空间构象,检测其抗原性；(3)将MAB363和OX-26的抗原表位优势克隆通过linker串联人工合成重组表位肽,进行功能检测；(4)将所得目的片段插入真核表达载体pcDNA3.1(+)构建真核表达质粒pcDNA3.1-NR1/TFR,利用电穿孔方法将其转化入减毒伤寒沙门杆菌制备重组表位疫苗；(5)通过western blot技术检测质粒在真核细胞中的表达。结果：(1)通过噬菌体十二肽库展示技术筛选出小鼠转铁蛋白受体单克隆抗体OX-26的抗原表位优势克隆氨基酸序列为GHIHSMRHHRPT.将人工合成的含目的氨基酸DDWVISTQSLKSGGGGSGGGGSGGGGSG HIHSMRHHRPT的多肽分别用MAB363和OX-26进行western blot检测,均能在2KD-8KD范围内产生条带,提示B细胞表位筛选正确,重组表位质粒设计合理,所表达的蛋白能够有效和相应抗体特异性结合。(2)将MAB363和OX-26的抗原表位优势克隆通过linker串联以保证两者的独立功能和空间构象,命名为S。采用相关软件预测重组表位蛋白Pro-S空间构象：Pro-S蛋白质序列在BLAST蛋白数据库中未发现同源性较高(>30%)的蛋白质,其内不含信号肽,属非跨膜蛋白,且不含半胱氨酸而未形成二硫化合物影响蛋白折叠和功能发挥,不含α螺旋以保证结构的稳定；NR1和TFR的抗原表位处于蛋白分子的表面,具有良好的抗原性、亲水性,提示Pro-S抗原性较好,可能刺激机体产生免疫反应并产生相应的抗体。(3)成功构建携带目的片段的真核表达质粒pcDNA3.1-NR1/TFR,命名为vec-s;并成功将其转化至减毒沙门菌,制备浓度为1.6×109cfu/ml的减毒活疫苗。(4)将质粒vec-s转染入真核细胞HEK293,48小时候后检测vec-s的瞬时表达,发现vec-s转染后的细胞总蛋白在MAB363和OX-26分别做western blot一抗检测时,在2KD-8KD范围内可见相应条带,与预测的分子量大小符合,提示真核表达质粒vec-s可在真核细胞中表达。结论：成功构建了NR1-TFR重组真核表达质粒,初步验证真核表达质粒vec-s能够在真核细胞中表达目的蛋白。为下一步的动物实验奠定了基础。