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目的:肿瘤的侵袭转移与患者的生存及预后密切相关。失巢凋亡(Anoikis)指细胞脱离原来生长部位,失去细胞-细胞、细胞-胞外基质间黏附而发生的一种程序性死亡。然而恶性肿瘤细胞常常通过多种方式获得对失巢后凋亡的抵抗能力,从而利于肿瘤的侵袭与转移。有研究表明,细胞发生上皮间质转化(Epithelial to Mesenchymal Transition,EMT)与失巢凋亡抵抗相关。由于EMT与失巢凋亡抵抗同为参与肿瘤转移的关键过程,揭示两者间的相关性对于阐明肿瘤的转移机制至关重要。基于此,本研究利用转化生长因子β(TGF-β)长期处理非小细胞肺癌细胞株获得EMT模型,观察细胞EMT后迁移力及失巢凋亡抵抗的影响;同时观察细胞在失巢状态下EMT相关分子表达的变化,从上述两方面探讨EMT与失巢凋亡抵抗的相关性。方法:1细胞培养人非小细胞肺癌H358及A549细胞株,培养于含10%胎牛血清、100U/m L青霉素、100 U/m L链霉素的RPMI-1640培养基,37℃、5%CO2培养,细胞贴壁生长,常规传代。2 TGF-β1长期处理细胞给予H358及A549细胞5ng/m L TGF-β1长期处理,构建EMT细胞模型(标记为:H358-TGF-β,A549-TGF-β),于处理后21天收集细胞检测EMT相关分子的表达。3细胞强制失巢处理将浓度为10mg/m L的Poly-HEMA溶液铺于6孔培养板,每孔体积1.5m L,过夜干燥备用。将调整好浓度的细胞悬液均匀铺于板中,37℃,5%CO2培养。4 Real-time PCR提取细胞总RNA,应用Real-time PCR方法,检测H358/H358-TGF-β、A549/A549-TGF-β细胞在贴壁(Attached,A)及失巢(Detached,D)状态下EMT相关分子(CDH1、CDH2、Vimentin、Snail、ZEB1及ZEB2)m RNA水平的表达情况。参照Applied Biosystems公司提供的Comparative Ct(ΔΔCt)方法计算目的基因的相对表达量。5蛋白免疫印迹(Western blot)提取细胞总蛋白,采用蛋白免疫印迹方法检测上述细胞在A或D状态下EMT相关分子E-cadherin(E-Ca)、N-cadherin(N-Ca)、Vimentin、Snail在蛋白水平的表达情况。6细胞划痕实验分别于划痕后0-72h观察细胞在划线两侧的生长情况,于显微镜下观察并拍照,每组实验重复三次。7 Transwell小室迁移实验2~6×104个细胞接种于小室上层,于接种后不同时间,固定染色后于显微镜下观察下室细胞的迁移情况。倒置显微镜下任取10个视野,计数穿膜细胞的平均值。每组实验重复三次。8 FCM检测细胞凋亡采用Annexin-V/PE试剂盒,通过流式细胞仪检测各组细胞在A或D状态下的凋亡情况,应用Flow Jo 7.6软件进行数据分析。9台盼蓝计数死细胞采用台盼蓝染色方法,观察各组细胞在A或D状态下的死亡情况。10统计方法应用SPSS Statistics17.0软件进行分析,数据分析采用两样本t检验,计量资料以均数±标准差(x±SD)表示。P<0.05认为差异具有统计学意义。结果:1 TGF-β1长期处理H358、A549细胞构建EMT细胞模型1.1细胞形态改变:分别给予H358与A549细胞TGF-β1连续处理21天,细胞形态发生明显改变。与各自原始细胞相比,H358-TGF-β及A549-TGF-β细胞均变为细长,类似于纺锤体形,形态改变支持细胞发生上皮向间叶样转变(EMT)。1.2 EMT相关分子的表达情况:1.2.1 TGF-β1长期处理H358细胞:TGF-β1处理后7-21天,细胞中上皮标记分子E-Ca在m RNA及蛋白水平均显著低于未处理组细胞,而间叶标记分子CDH2、Vimentin及Snail在两个水平均升高。以上结果证实,TGF-β1连续刺激21天诱导H358细胞发生EMT转化,细胞标记为H358-TGF-β。1.2.2 TGF-β1长期处理A549细胞:给予A549细胞TGF-β1连续刺激21天,上皮标记分子E-Ca在m RNA及蛋白水平均显著低于未处理组细胞;而间叶标志物N-cadherin、Vimentin及Snail表达逐渐增加。综合考虑m RNA水平及蛋白表达结果,后续实验选择连续给予TGF-β1 21天作为EMT细胞模型,细胞标记为A549-TGF-β。1.3细胞迁移力的改变:划痕实验结果显示,H358-TGF-β细胞划痕愈合面积(62.6±2.5%)明显大于对照组(9.3±0.83%),差异有统计学意义;与A549细胞相比,A549-TGF-β细胞划痕愈合面积显著增高(47.7±2.08%V.S.98.6±0.65%,P<0.05)。此外,Transwell实验结果同样表明,H358-TGF-β、A549-TGF-β细胞穿入下室的细胞数显著高于各自的对照组细胞(均P<0.05)。综上,TGF-β1长期处理可诱导H358和A549细胞发生EMT转化,同时细胞迁移力亦显著增强。2细胞EMT后对失巢凋亡抵抗的检测2.1失巢条件下细胞形态的变化:失巢培养48小时后,光镜下观察细胞以大小不等的微球方式生长,折光性强。H358细胞间结合紧密,呈串珠状聚集,而H358-TGF-β细胞间结合较疏松,散在分布。与原始细胞相比,A549-TGF-β细胞间排列更为疏松。2.2贴壁及失巢条件下细胞凋亡的检测:消化细胞制备细胞悬液,分为2组分别在贴壁与失巢条件下进行培养,48小时后收集细胞采用Annexin V-PE染色检测细胞凋亡情况。2.2.1贴壁状态下细胞凋亡检测:与H358相比,H358-TGF-β细胞凋亡率降低(11.67±1.36%V.S.5.52±0.22%,P<0.05)。但是A549-TGF-β细胞凋亡率与A549相比无显著变化(P>0.05)。2.2.2失巢状态下细胞凋亡显著增加:与细胞贴壁生长相比,各细胞在失巢状态下凋亡率均显著增加,P值均小于0.05。[H358:11.67%±1.36%(A),51.35%±1.34%(D);H358-TGF-β:5.52%±0.22%(A),22.0%±0.42%(D);A549:5.2±0.28%(A),24.22±3.75%(D);A549-TGF-β:4.24±1.56%(A),10.65±0.21%(D)]。2.2.3细胞EMT后可抵抗失巢凋亡:失巢状态下,H358-TGF-β细胞的凋亡率(22%±0.42%)显著低于H358细胞(51.35%±1.34%,P<0.05)。此外,A549-TGF-β细胞在失巢状态下的凋亡率明显低于A549细胞(10.65±0.21%V.S.24.22±3.75%,P<0.05)。上述结果表明,细胞发生EMT后,能够耐受失巢引起的细胞凋亡,表现为失巢凋亡抵抗。2.3台盼蓝染色计数细胞死亡情况:台盼蓝染色结果显示,各组细胞在失巢与贴壁条件下培养,死细胞率无明显差别(P>0.05),结果表明失巢培养48h后细胞为存活状态。3失巢状态下细胞EMT相关分子表达的变化分别于失巢与贴壁状态下收集细胞提取总RNA及总蛋白,采用Real-time PCR方法与Western Blot方法,检测EMT相关分子在m RNA及蛋白水平的表达情况。3.1 H358/H358-TGF-β细胞:3.1.1 H358细胞:在m RNA水平,与贴壁状态相比(作为1),失巢后H358细胞间叶标记分子Snail(FC=2.57)及ZEB2(FC=1.56)m RNA表达增高,CDH2m RNA表达降低(FC=0.10),其他指标无显著变化。在蛋白水平,细胞失巢后Snail蛋白及Vimentin表达增高,E-Ca蛋白表达无明显变化。3.1.2 H358-TGF-β细胞:与贴壁组细胞相比,失巢组细胞上皮标记分子CDH1 m RNA表达降低(FC=0.21),间叶标记分子Snail、ZEB1及ZEB2 m RNA的表达均显著增加,CDH2及Vimentin m RNA表达无显著变化。Western bolt检测结果显示,失巢后H358-TGF-β细胞E-Ca蛋白表达降低,Vimentin及Snail蛋白表达增高。上述结果提示:失巢状态下H358和H358-TGF-β细胞间叶标记分子表达增加,以H358-TGF-β细胞更为显著。3.2 A549/A549-TGF-β细胞EMT相关基因表达情况:3.2.1 A549细胞:A549细胞失巢后,E-cadherin在m RNA水平(CDH1)及蛋白(E-Ca)水平表达均低于贴壁状态。Vimentin、Snail、ZEB1及ZEB2 m RNA的表达均升高,CDH2 m RNA水平无明显变化。同时,失巢后Vimentin及Snail蛋白表达较贴壁状态增加。3.2.2 A549-TGF-β细胞:与贴壁状态相比,失巢后细胞中CDH1 m RNA表达升高,但其蛋白水平未见显著变化。Vimentin、Snail、ZEB1及ZEB2 m RNA的表达均升高,同时Snail蛋白表达量亦显著升高。综合m RNA及蛋白水平的检测结果,提示失巢条件下A549/A549-TGF-β细胞中间叶标记分子表达显著增加。结论:1给予A549、H358细胞TGF-β1长期处理可诱导细胞发生EMT转换,同时伴随迁移能力显著增强。2 H358、H358-TGF-β、A549及A549-TGF-β细胞在失巢状态下细胞凋亡显著高于贴壁状态;细胞发生EMT后表现为对失巢凋亡的抵抗。3无论是原始细胞还是诱导EMT后的细胞模型中,失巢后细胞间叶标记分子的表达均出现一定程度地增加,同时伴或不伴上皮标记分子E-Ca的降低,提示细胞在失巢后倾向于保持在(部分)EMT状态。