目的hURAT1是维持血尿酸水平的关键离子通道,是导致原发性高尿酸血症的重要侯选基因。根据前期工作基础,第三内含子+11 G＞A SNP与原发性高尿酸血症遗传易感性密切相关。本研究拟进一步开展体外功能研究,探讨该点SNP是否通过影响hURAT1基因mRNA的可变剪接而改变hURAT1蛋白结构,近而增强肾近端小管对尿酸的重吸收,导致肾脏对尿酸的排泄减少以及高尿酸血症。方法提取正常人全血基因组DNA,进行PCR扩增第2外显子至第5内含子之间的全基因组序列片段,将纯化的扩增产物与表达载体pcDNA3.1（—）连接后转化DH5α感受态细胞。野生型重组质粒经BamHI和EcoRⅠ酶切后,应用核苷酸序列测定方法进行鉴定。应用定点突变技术改变上述野生型pcDNA3.1（—）—hURAT1重组质粒第三内含子+11 G→A,构建突变型pcDNA3.1（—）—hURAT1重组质粒。将野生型和突变型质粒设立为两组试验组,并分别设立阴性对照组和空白对照组,瞬时转染293T细胞使其在细胞内表达。提取各实验组细胞及细胞裂解液的RNA,逆转录成cDNA。以hURAT1基因的cDNA为模板,根据所插入片段设计5’和3’端寡核酸引物,分别扩增各组mRNA序列。1%琼脂糖凝胶电泳分离产物片段,割胶纯化目的条带,核苷酸序列鉴定。结果1.野生型pcDNA3.1（—）—hURAT1重组质粒经酶切和测序显示hURAT1片段插入序列和方向正确,符合pcDNA3.1（-）载体的读码框架,证明目的基因已成功转入pcDNA3.1（-）载体中。2.突变型pcDNA3.1（—）—hURAT1重组质粒经过定点突变改变后测序鉴定,hURAT1基因第三内含子+11已发生G→A点突变,其它序列与野生型hURAT1重组质粒的序列和方向均完全一致,并且符合pcDNA3.1（-）载体的读码框架,证明突变重组体已构建成功。3.各细胞实验组cDNA经PCR扩增凝胶电泳,结果显示转染野生型pcDNA3.1-hURAT1组出现了一条特异性的条带,转染突变型pcDNA3.1-hURAT1组出现了两条特异性的条带,阴性对照组和空白对照组无特异性的条带。割胶纯化所出现的目的条带,进行测序并与GeneBank中的序列比对,结果显示突变型的其中一条条带发生了可变剪接改变,第五外显子的编码序列完全缺失,另一条与野生型序列一致。结论hURAT1基因第三内含子+11G＞A SNP体外功能研究证实该点SNP影响hURAT1 mRNA可变剪接过程,第五外显子编码基因完全缺失,产生hURAT1剪接异构体,从而增加肾脏对尿酸盐的重吸收,引发原发性高尿酸血症。