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目的:糖尿病肾病(DN)是由糖尿病(DM)患者高血糖引发的一种微血管病变,是DM最严重的并发症之一。随着对DN研究的不断深入,人们发现炎症在DN的发生和发展中起着至关重要的作用。CXCL8与其趋化因子受体(CXCR1/2)结合,招募中性粒细胞浸润,进而引发炎症反应。CXCL8(3-72)K11R/G31P(以下简称G31P),作为CXCR1/2受体拮抗剂,可与CXCL8竞争性结合CXCR1/2受体,从而抑制CXCL8的生物学活性,发挥其抗炎作用。本实验通过建立DM小鼠模型,来探讨G31P对DN肾损伤的抑制作用。方法:1体内实验1.1建立DM小鼠模型并分组:实验选取6周龄的C57BL/6J雄性小鼠,通过高脂饮食(HFD)联合链脲佐菌素(STZ)腹腔注射的方法,建立DM小鼠模型。根据研究内容将实验分成以下四组:正常对照组(以下简称Cntl组)、Cntl+G31P组、DM组和DM+G31P组。其中,Cntl+G31P组和DM+G31P组给予小鼠皮下注射G31P,剂量为0.5 mg/kg,两天一次,而Cntl组和DM组注射相同体积的生理盐水,治疗周期为1个月。1.2动物组织样本采集:治疗期间,每周监测各组小鼠的体重、进食量、饮水量、尿量和血糖等变化情况。治疗一个月后,处死全部小鼠,采集和处理小鼠标本:小鼠眼球取血,室温静置1 h后,离心取血清,-80℃分装保存。剥离小鼠体内双侧肾脏组织,称重并拍照。1.3实验检测:部分肾脏组织用4%多聚甲醛溶液固定,行h&e、过碘酸雪夫(pas)、天狼猩红(siriusred)和免疫组织化学(ihc)等染色:h&e染色观察肾脏组织病理结构,pas染色观察肾小球硬化程度,siriusred染色观察胶原沉积情况,ihc检测肾脏组织中collageniv、mpo、f4/80、p-nf-kb、cxcr1、cxcr2、podocin和nephrin的表达情况;部分肾脏组织用3%戊二醛和1%四氧化锇双重固定,电镜(tem)观察肾脏组织肾小球基底膜厚度(gbm)厚度和足突融合情况;其余肾脏组织用于提取rna和蛋白,rt-pcr检测炎症及纤维化相关因子的表达情况,westernblotting检测信号通路中erk1/2、jak2和stat3磷酸化蛋白的表达水平等。2体外实验:2.1细胞的培养及分组:体外培养人肾小球系膜细胞(hrmcs),将6-15代hrmcs分成以下四组:(a)正常血糖组(ng组),细胞用dmem培养基培养;(b)甘露醇组(mc组),细胞dmem培养基中加24.4mm的甘露醇做高渗对照;(c)高糖组(hg组),细胞dmem培养基中加24.5mm的葡萄糖刺激;(d)g31p治疗组(hg+g31p组),细胞在高糖刺激前1h加100ng/ml的g31p预处理。2.2实验检测:用cck-8实验检测g31p对hrmcs的细胞毒性作用;rt-pcr检测各组细胞中cxcl8、tnf-a、tgf-β和ctgf的表达水平;westernblotting检测各组hrmcs信号通路中erk1/2、jak2和stat3磷酸化蛋白的表达水平。结果:1体内实验1.1g31p对dm小鼠肾脏具有保护作用:观察肾脏大小并计算肾脏/体重比值发现,g31p治疗可改善dm引起的肾脏肥大症状,肾脏/体重比值降低(p<0.01);dm小鼠的血糖、进食量、饮水量和尿量均显著升高,g31p治疗后dm小鼠的饮水量和尿量显著减少(p<0.01);g31p治疗可显著降低dm小鼠的bun、ccr和uacr水平(p<0.01);h&e染色观察发现,dm组小鼠肾小球肥大,系膜基质增多,部分肾小管上皮细胞肥大、空泡变性、萎缩及坏死。g31p治疗后肾小管和肾小球损伤减轻。tem观察发现,dm组小鼠基底膜呈现不同程度弥漫性增厚,足突增宽、融合甚至消失,足突细胞数量减少,g31p治疗后肾脏组织病理改变得到明显缓解;rt-pcr和ihc实验结果均表明,与cntl组相比,dm组肾脏nephrin和podocin表达水平显著下降,g31p部分恢复二者表达水平(p<0.05)。1.2 G31P抑制DM小鼠肾脏组织炎症反应:RT-PCR检测发现,DM组小鼠IL-1β、IL-6和TNF-α表达量显著增加,G31P治疗可显著降低三者表达水平(P<0.01);IHC染色观察发现,NF-κB、MPO和F4/80在DM组小鼠的肾脏组织中表达显著增高,G31P治疗后三者表达水平显著降低(P<0.01);ELISA、RT-PCR和IHC等实验结果表明,CXCL8、CXCR1和CXCR2在DM组小鼠血清或肾脏组织中表达显著上升,G31P治疗后三者水平均有不同程度的下降(P<0.05、P<0.01);Western blotting结果显示,ERK1/2、JAK2和STAT3的磷酸化蛋白水平在DM组表达显著升高,G31P治疗后三者表达量显著下降(P<0.05、P<0.01)。1.3 G31P改善DM小鼠肾脏组织的纤维化:PAS染色结果显示,DM小鼠肾脏组织内PAS阳性染色物质明显增多,肾小球硬化指数(GSI)升高,G31P治疗后,GSI水平明显降低(P<0.01);Sirius red染色观察发现,G31P治疗可显著改善DM小鼠肾脏组织内的胶原沉积情况(P<0.01);IHC检测发现,DM小鼠Collagen IV表达水平比Cntl组明显升高,G31P治疗后,其表达水平明显下降(P<0.05);RT-PCR和Western blotting研究结果显示,DM组小鼠肾脏组织高表达TGF-β和CTGF,G31P治疗后二者表达水平显著下降(P<0.05、P<0.01)。2体外实验CCK-8实验检测结果显示:适当剂量的G31P对系膜细胞增殖没有影响,表明其没有细胞毒性;RT-PCR检测发现,在HRMCs中,与NG组相比,HG组TNF-α、TGF-β和CTGF表达量显著升高,G31P治疗显著降低三者mRNA的表达水平(P<0.05)。另外,在30 mmol/L高糖刺激下,CXCL8的mRNA表达量显著增高,峰值在刺激6 h后出现;高糖刺激可诱导HRMCs中ERK1/2、JAK2和STAT3的磷酸化蛋白表达增高,G31P治疗后三者表达量显著下降(P<0.05、P<0.01)。结论:(1)DN小鼠肾脏组织中炎性细胞大量聚集,炎症相关因子表达明显升高,推测炎症在DN的发生和发展中起到非常重要的作用。(2)通过与CXCR1/2受体结合,G31P能够减轻DN小鼠的肾脏组织损伤,减少促炎和促纤维化因子的表达,发挥其肾脏保护作用,为临床上治疗DN提供新的思路和理论基础。