1研究背景随着社会的发展交通运输业的繁荣，骨折已成为临床的常见病，多发病。因各种原因发生的骨折延迟愈合和不愈合严重危害人们的生存质量，如何促进骨折愈合一直是骨科届研究的热点问题。中药治疗骨折历史悠久，疗效确切，因其经济简便而引起越来越多的重视与关注，是目前治疗骨折的主要手段之一。辨证论治是祖国医学治疗疾病的理论核心和精髓，祖国医学根据骨折愈合过程中的证侯与病理组织学变化规律将骨折愈合过程分为三期—早期、中期与后期，根据不同时期辨证治疗，从而提出骨折三期治疗，成为现代中医药治疗骨折的指导原则，但是中医骨折三期治则的提出是基于前人经验的总结，缺乏科学的实验依据。药物作用机制仍停留在宏观、模糊的水平。如何保持和发扬中医骨伤科的骨折治疗特色与优势，使中医药现代化走向世界是不可回避的问题。既往对骨折三期治则的研究极少，而且多为临床疗效的初步粗略观察，均是与模型组或成药之间的比较，从基因水平揭示中医骨折三期治则的作用及其机制系统的实验研究，尚属空白。本研究拟通过动物实验，应用免疫组化技术和原位杂交技术检测骨折局部各种组织骨生长因子BMP-2、BMP-2 mRNA，观察骨折三期治疗、一期治疗及阳性药物治疗对骨折愈合过程中骨生长因子表达及分布规律的影响，从分子水平阐明中医骨折三期治则对骨折愈合的作用及其机制，探讨中医骨折治疗的最佳分期方法，从现代医学的角度为中医药治疗骨折提供更为科学的理论根据，指导骨折的治疗。2材料与方法2．1实验动物及建立骨折模型新西兰家兔140只，于双侧桡骨中下1／3用特制骨锯造成3mm完全骨质缺损的动物模型，不作任何固定。术后用SPSS软件产生随机数字的方法将140只家兔随机分为四个实验组，每组35只。分别为中药三期治疗组(简称三期组)、中药一期治疗组(简称一期组)、模型对照组(简称模型组)和阳性药物组(简称阳性药组)，每个实验组再随机分为7个小组，每小组5只家兔。2．2干预方法本实验所用的基本方剂是采用高等中医药院校统编教材《中医正骨学》和《骨伤科学》中的肢伤一方、二方及三方。三期组按照中医骨折三期治疗原则及家兔桡骨中下段骨折愈合的组织学变化将骨折愈合过程分为三期，早期为术后1～7天，相当于血肿机化演进期，给予肢伤一方；中期为术后8～28天，相当于原始骨痂形成期，给予肢伤二方；后期为术后29天以后，相当于改造塑型期，给予肢伤三方。一期组将骨折愈合过程不分期，给予肢伤一方、二方与三方的综合加减方(一期方)。阳性药组将骨折愈合过程不分期，给予骨折挫伤胶囊水溶液。给药剂量为家兔对人等效剂量的两倍，每日分两次灌胃。模型组给予等量蒸馏水灌胃。2．3标本处理术后第3、6、9、14、28、42、56天每个实验组随机抽取一小组家兔用空气栓塞法处死，取出双侧桡骨标本，在同一条件下拍摄CR片，根据断端边缘、骨痂量、骨痂密度、骨痂边缘分别对骨折愈合情况进行记分。再取左侧桡骨标本经固定、脱钙、包埋等程序后采用免疫组化和原位杂交方法观察骨折愈合不同时间点骨痂BMP-2因子及其mRNA表达情况。采用显微图像采集系统对免疫组化及原位杂交切片骨折断端附近的骨折端骨干细胞、外骨膜、内骨膜、骨折端血肿、纤维骨痂、软骨骨痂、骨小梁、小梁间组织及骨髓腔组织各取两个高倍镜视野，并用ImagePro plus 5.0图像分析软件对这些组织中的阳性表达细胞的平均光密度值(MOD)进行测定。2．4统计分析应用SPSS统计软件对实验数据进行统计分析。对骨折愈合过程中X线肉眼评分结果和骨痂各种组织阳性表达细胞MOD值的组间差异进行统计分析。结果采用均数±标准差((?)±s)表示。检验水准：α=0.053结果3．1模型组、一期组、三期组与阳性药组骨折愈合过程中影响X线肉眼评分各组间比较显示：三期组与一期组极显著高于模型组与阳性药组，P＜0.01。术后6天：三期组与一期组极显著高于模型组，P＜0.01；三期组极显著高于阳性药组，P＜0.01。术后9天：三期组与一期组极显著高于模型组与阳性药组，P＜0.01。3．2模型组、一期组、三期组与阳性药组骨折愈合过程中BMP-2表达MOD值变化3．2．1各组骨干细胞BMP-2表达各组间比较显示：一期组与三期组极显著高于模型组，P＜0.01；阳性药组显著高于模型组，P＜0.05；三期组显著高于一期组，P＜0.05；三期组极显著高于阳性药组，P＜0.01。术后9—42天：三期组极显著高于模型组，P＜0.01；三期组显著高于阳性药组，P＜0.05。三期、一期组与阳性药组表达呈三峰曲线。模型组高峰出现的早，但峰值低。中药组同时出现高峰，三期组峰值最高。3．2．2各组骨折端血肿BMP-2表达各组间比较显示：一期组显著高于模型组，P＜0.05；三期组极显著高于模型组，P＜0.01。术后6天：三期组极显著高于模型组，P＜0.01；一期组显著高于模型组，P＜0.05。术后9—14天各组无差别。阳性药组表达呈一双峰曲线。三期组与一期组高峰比阳性药组提前3天，模型组高峰出现早，但峰值低，三期组峰值最高，三期组提高了峰值水平。3．2．3各组外骨膜BMP-2表达各组间比较显示：三期组与一期组极显著高于模型组，P＜0.01：一期组显著高于阳性药组，P＜0.05；三期组极显著高于阳性药组，P＜0.01。术后9天，三期组显著高于模型组，P＜0.05。术后14天：三期组极显著高于模型组，P＜0.01；一期组与阳性药组显著高于模型组，P＜0.05；三期组显著高于阳性药组，P＜0.05。三期组、模型组与一期组呈一双峰曲线。一期组高峰出现的早但峰值低，三期组术后14天出现高峰，峰值显著高于模型组。3．2．4各组内骨膜BMP-2表达各组间比较显示：三期组与阳性药组极显著高于模型组，P＜0.01；一期组有高于模型组的趋势，P＞0.05。术后14天：三期组显著高于模型组，P＜0.01；阳性药组有高于模型组的趋势。术后42天：阳性药组与三期组有高于模型组的趋势，P＞0.05。三期组、阳性药组与一期组呈一双峰曲线。一期组高峰出现的早但峰值低，三期组与阳性药组同时出现高峰，三期组峰值显著高于其他各组。3．2．5各组骨髓腔BMP-2表达各组间比较显示：一期组与三期组极显著高于模型组，P＜0.01；阳性药组显著高于模型组，P＜0.05；三期组显著高于阳性药组，P＜0.05。术后9天：三期组显著高于模型组，P＜0.05；一期组有高于模型组的趋势；阳性药组有高于一期组的趋势。术后14天，三期组显著高于模型组，P＜0.05。三期组与阳性药组呈三峰曲线，一期组与模型组表达呈一双峰曲线。各中药组高峰比模型组提前5天，三期组峰值显著高于模型组，术后9—42天三期组一直持续较高水平，说明三期组提高了峰值水平，并延长了高峰持续时间。3．2．6各组软骨骨痂BMP-2表达各组间比较显示：一期组极显著高于模型组，P=0.01；三期组与阳性药组显著高于模型组，P＜0.01。术后9天：三期组极显著高于模型组，P＜0.1；三期组显著高于一期组，P＜0.05。术后14天，三期组极显著高于模型组，P＜0.01。术后42天，三期组显著高于模型组，P＜0.05。各组表达曲线呈一双峰曲线，一期组、三期组与模型组高峰同时出现，阳性药组无高峰出现。三期组峰值极显著高于模型组，三期组提高了峰值水平。3．3模型组、一期组、三期组与阳性药组骨折愈合过程中BMP-2 mRNA表达MOD值变化3．3．1各组骨干细胞BMP-2 mRNA表达各组间比较显示：三期组有高于一期组与阳性药组的趋势，P＞0.05；极显著高于模型组，P＜0.01；各中药组都极显著高于模型组，P＜0.01。术后9天，三期组显著高于模型组，P＜0.05。术后14—28天：三期组显著高于模型组，P＜0.05；三期组有高于一期组和阳性药组的趋势。阳性药组呈一双峰曲线，三期组与一期组表达呈一三峰曲线，中药组均同时出现高峰，比模型组提前了5天，并显著提高了峰值水平，三期组峰值最高。3．3．2各组骨折端血肿BMP-2 mRNA表达各组间比较显示：一期组与三期组极显著高于模型组，P＜0.01；阳性药组显著高于模型组，P＜0.05；三期组显著高于阳性药组，P＜0.05。术后6天，三期组有高于模型组的趋势，P＞0.05。术后9天，三期组与一期组极显著高于模型组，P＜0.01。三期组与一期组表达呈双峰曲线。三期组与一期组同时出现高峰，但三期组峰值最高，其他组无高峰。3．3．3各组外骨膜BMP-2 mRNA表达各组间比较显示：各中药组显著高于模型组，P＜0.01；三期组有高于一期组的趋势；三期组显著高于阳性药组，P＜0.05。术后9天，三期组显著高于模型组，P＜0.05。术后14天：三期组极显著高于模型组，P＜0.01；中药组显著高于模型组，P＜0.05，三期组显著高于阳性药组，P＜0.05。三期组表达呈一三峰曲线，阳性药组与一期组呈一双峰曲线，三期组与阳性药组同时出现高峰，比一期组提前5天，三期组峰值显著高于模型组。3．3．4各组内骨膜BMP-2 mRNA表达各组间比较显示：三期组有高于一期组的趋势，P＞0.05；三期组与一期组极显著高于模型组，P＜0.01；三期组极显著高于阳性药组，P＜0.01；一期组显著高于阳性药组，P＜0.05。术后9天：三期组显著高于模型组，P＜0.05，三期组有高于阳性药组的趋势；术后14天：三期组显著高于模型组，P＜0.05；一期组显著高于模型组，P＜0.05。三期组与一期组表达呈三峰曲线，三期组高峰比一期组提前了3天，三期组峰值有高于其他各组的趋势，三期组一直维持较高的水平，高峰出现早，持续时间长。3．3．5各组骨髓腔BMP-2 mRNA表达各组间比较显示：三期组与一期组极显著高于模型组，P＜0.01；三期组极显著高于阳性药组，P＜0.01；一期组显著高于阳性药组，P＜0.05。术后9—14天：三期组极显著高于模型组，P＜0.01；一期组显著高于模型组，P＜0.05；三期组显著高于阳性药组。三期组与一期组表达呈三峰曲线，阳性药组表达呈双峰曲线。三期组与一期组比阳性药组提前5天出现高峰，三期组峰值显著高于模型组。3．3．6各组软骨骨痂BMP-2 mRNA表达各组间比较显示：中药组极显著高于模型组，P＜0.01；三期组显著高于阳性药组，P＜0.05。术后9—42天：三期组极显著高于模型组，P＜0.01；一期组与阳性药组显著高于模型组，P＜0.05。一期组表达呈一双峰曲线。三期组与一期组高峰同时出现，比模型组与阳性药组高峰提前了14天，三期组与一期组峰值极显著高于模型组，阳性药组峰值显著高于模型组，三期组一直维持较高的水平，三期组提高了峰值水平。3．3．7各组小梁间组织BMP-2 mRNA表达各组间比较显示：中药组都极显著高于模型组，P＜0.01；三期组有高于阳性药组的趋势。术后14天：三期组显著高于模型组，P=0.01；一期组显著高于模型组，P＜0.05。各组高峰同时出现，表达呈一双峰曲线，三期组提高了峰值水平。4结论1)中药能促进骨折愈合过程中不同组织BMP-2、BMP-2 mRNA表达，说明中药干预有促进骨折愈合的作用。2)骨折三期治疗在不同组织表达都有促进BMP-2、BMP-2 mRNA表达作用。这是骨折三期治疗促进骨折愈合的作用机制之一。3)中药对骨折愈合不同阶段各种组织的BMP-2、BMP-2 mRNA表达有不同的作用，根据骨折愈合不同阶段施以相应治则的分期治疗较不分期治疗对于BMP-2、BMP-2mRNA表达的促进作用更明显，显示中医骨折分期治疗是必要的。4)中医骨折三期治则分别针对骨折愈合不同时期的病理变化，采用相应的中药可以促进相应部位的BMP-2、BMP-2 mRNA表达，是比较科学的骨折分期治疗方法。5创新点1)从蛋白质和基因水平揭示骨折愈合过程中不同组织BMP-2、BMP-2 mRNA表达特征骨折愈合是个复杂的过程，有多种组织参与并且相互联系，目前对于骨折愈合过程中BMP表达的研究，均是研究骨痂中BMP的定量变化，因此不能反应骨折愈合过程中各种组织的变化特征。揭示不同组织BMP-2、BMP-2 mRNA表达特征，未见报道。2)从基因水平骨诱导方面揭示骨折三期治则的部分作用机制目前对中药促进骨折愈合的研究主要集中在单味药和单一方剂，对于骨折三期治则的研究较少。通过研究骨折愈合过程中BMP-2、BMP-2 mRNA表达变化情况，揭示骨折三期治则促进骨折愈合的作用机制，未见报道。