家蚕的一生主要受到JH与20E的调控。其中,JH由咽侧体合成并分泌至血淋巴中,与血淋巴中游离的保幼激素结合蛋白（JHBP）结合,被运送到相应的靶器官或者靶细胞,调控家蚕的生长、发育、蜕皮和变态。已有的研究报道表明家蚕后部丝腺有一个特异表达的保幼激素结合蛋白基因（BmJHBPd2）,该基因是否参与了丝蛋白合成,具有什么样的功能目前还不清楚;为了研究BmJHBPd2在丝蛋白合成中的功能,本研究通过转基因过表达技术和CRISPR/Cas9敲除技术对其开展了研究。主要研究结果如下:1、敲除BmJHBPd2对丝蛋白合成的影响为了探究BmJHBPd2功能,本研究根据BmJHBPd2的基因序列设计并合成了3个sg RNA,在家蚕胚胎早期与Cas9蛋白混合注射。首先,对注射的G0代进行基因组缺失检测,发现有BmJHBPd2被成功敲除的个体;然后挑选敲除个体自交后继代饲养,对其部分后代提取基因组进行检测,发现BmJHBPd2基因出现碱基的缺失,插入和碱基的突变三种敲除形式,主要以碱基缺失为主。对敲除个体的BmJHBPd2的开放阅读框（ORF）进行克隆测序发现敲除个体为杂合形式,并出现不同的敲除形式,测序结果与基因组结果一致,蛋白序列预测结果显示该基因提前出现了终止密码子。利用q RT-PCR检测丝腺BmJHBPd2的表达量,发现该基因表达量显著降低;通过q RT-PCR对敲除个体丝蛋白基因Bm Fib-H,Bm Fib-L,Bm P25的表达情况进行调查发现,与对照相比,丝蛋白基因的表达均显著下调。然后,茧质情况调查结果显示BmJHBPd2基因的敲除个体全茧重、茧层重、蛹重都显著下调,丝蛋白合成减少,并出现25%的裸蛹。这些结果表明BmJHBPd2不仅参与了家蚕个体的发育,而且参与了丝蛋白的合成。2、过表达BmJHBPd2在丝蛋白合成的影响对BmJHBPd2在不同产丝量品种丝腺组织进行表达量的比较,发现高丝量品种该基因的表达量显著高于低丝量品种。为了探索过表达BmJHBPd2是否可以增加丝蛋白的合成,我们克隆了BmJHBPd2的ORF,构建了以丝素轻链（Fib-L）为启动子,piggy Bac载体为连接骨架,连接Myc外源表达标签的转基因过表达载体。经显微注射和阳性个体筛选等,成功获得了BmJHBPd2过表达品系。首先对转基因品系的BmJHBPd2表达量进行了检测,结果显示阳性个体5龄第3天的后部丝腺BmJHBPd2表达量较野生型显著提高;在蛋白水平,通过Western blot检测,过表达个体检测到外源Myc标签表达的蛋白条带,结果与RNA水平检测结果一致。在相同的发育时期对阳性个体丝腺进行观察未发现有显著差异;茧质情况调查结果表明,BmJHBPd2阳性个体的全茧重、茧层重、蛹重以及茧层率均显著降低。后期,又对5龄第1天阳性个体进行保幼激素类似物（Juvenile hormone analogue,JHA）涂抹,调查其对丝蛋白合成的影响,发现过表达BmJHBPd2的茧丝量及茧层率仍旧低于野生型对照。该结果表明在后部丝腺过表达BmJHBPd2不但没有增加丝蛋白的合成,反而产生了抑制效果。3、高效液相色谱法测定家蚕后部丝腺保幼激素IIIBmJHBPd2是丝腺的保幼激素结合蛋白,根据三维结构预测,与已报道的JHBP有类似结构,应该是可以结合JH的。在第一部分,通过敲除技术成功敲除该基因后严重影响丝蛋白的合成,表明该基因在丝蛋白合成过程中发挥了功能,但丝腺中是否有JH还不清楚。为了探究这个问题,我们利用HPLC对丝腺JH的含量进行了测定。随机选取10头932品系5龄第5天的家蚕,解剖后部丝腺,液氮研磨,最终获得2.69 g的后部丝腺粉末。用甲醇和正己烷萃取法进行JH的萃取,利用旋蒸法进行萃取液的浓缩,回融与甲醇流动相中,最终了获得1 m L的后部丝腺激素萃取物。在样品进行检测前,首先对JH I和JH III标准品及空白对照二甲基亚砜（DMSO）的出峰时间进行了检测,发现JH I和JH III在53.078 min、26.945 min有各自的特征峰出现。然后对后部丝腺激素萃取物上机检测,在26.887min检测到一个峰值,与JH III的出峰时间基本一致,但在53 min没有检测到峰值。为了进一步确认该特征峰是JH III的峰值,还利用内标法进行了测定,即在样品中加入JH III,发现样品在26.887 min处的峰面积有明显的增加,但峰未发生偏移,该结果表明在家蚕932品系5龄第5天的后部丝腺组织中有JH III,但是JH I是否存在还需要进一步的验证。根据JH III标准品的标准曲线,获得JH III浓度计算公式为y=30452x-1E+06,通过计算家蚕后部丝腺JH III的浓度为有12.39μg/g。根据该结果,我们推测家蚕后部丝腺的BmJHBPd2与丝腺中的JH III极有可能结合JH III而发挥相应的功能。综上,BmJHBPd2参与了丝蛋白的合成,对丝蛋白的合成有十分重要的作用,其表达量过高或者过低都会影响丝蛋白的合成,并对家蚕的发育具有一定的影响。推测BmJHBPd2在这过程中通过结合丝腺中游离的JH平衡丝腺中的JH的滴度,从而协调丝蛋白的合成。