日本脑炎病毒(Japaneseencephalitisvirus)是一种可以由蚊子传播并能造成脑炎等症状的黄病毒，主要在东亚和南亚流行。约30亿人生活在日本脑炎病毒流行的地区。到目前为止，除了免疫接种没有任何有效的抗病毒治疗方法。因此，急需有效的抗病毒制剂来控制日本脑炎病毒的感染。植物来源的抗病毒制剂目前被广泛研究，从中研发得到具有抗病毒效果的制剂是一个新的研究方向。本论文旨在研究重组Griffithsin(GRFT)和美洲商陆抗病毒蛋白(PAP)抑制日本脑炎病毒感染的能力，可为研发新型抗病毒制剂提供新的思路。GRFT是红藻Griffithsiasp.中分离得到的能够结合糖基的蛋白，该蛋白能够通过阻止一些病毒与细胞间的粘附来起到阻止病毒感染细胞的作用，这些病毒包括HIV-1等。PAP是美洲商陆(Phytolaccaamericana)中存在的一种N-糖苷酶核糖体失活蛋白，具有抗HIV-1等病毒的功能。
　　本论文有四部分组成:
　　1.抗病毒蛋白GRFT的基因合成，克隆，原核表达及纯化:通过SOE-PCR方法从头合成GRFT基因，将基因连接入pCold-I载体构建pCold-I-GRFT表达质粒。所得质粒的正确性由限制性内切酶酶切和基因测序确认。GRFT在大肠杆菌中能够可溶表达，并进一步通过镍亲和层析和分子筛方法纯化。蛋白的纯度由SDS-PAGE鉴定，并由Westernblot的方法确认其正确性。纯化的GRFT蛋白中的内毒素通过Detoxi-Gel去内毒素柱去除。纯化的蛋白用于制备多抗用于后续的GRFT与病毒的结合实验。
　　2.Griffithsin抑制日本脑炎病毒感染的体内外实验:体外细胞实验结果表明在细胞感染病毒前用GRFT处理BHK-21细胞可以呈剂量依赖性抑制病毒感染。100g/mlGRFT可以起到99％的抑制作用，而265ng/ml的GRFT(20nM)可以起到50％的抑制作用。结合实验表明GRFT可以通过结合JEV病毒粒子起到抑制病毒感染的作用。小鼠实验表明感染病毒前腹腔内注射GRFT(5mg/kg)可以完全抑制腹腔注射感染日本脑炎病毒造成的死亡。
　　3.商陆抗病毒蛋白PAP的克隆，原核表达及纯化:通过PCR的方法从全长PAP基因上扩增编码成熟PAP蛋白的基因，将基因连接入pET-28a(+)载体中构建pET28-PAP表达质粒。所得质粒的正确性由限制性内切酶酶切和基因测序确认。GRFT在大肠杆菌中能够可溶表达，我们通过镍亲和层析和分子筛方法纯化。蛋白的纯度由SDS-PAGE鉴定。并由Westernblot的方法确认其正确性。纯化的GRFT蛋白中的内毒素通过Detoxi-Gel去内毒素柱去除。纯化的蛋白用于制备多抗用于后续的PAP入胞实验。
　　4.PAP蛋白抑制日本脑炎病毒感染的体内外实验:空斑形成实验、实时定量PCR和Westernblot的结果表明PAP能够呈剂量依赖性抑制病毒感染，IC50300ng/ml(23.1nM)。去嘌呤实验表明PAP抑制日本脑炎感染的作用与其对病毒基因组RNA的去嘌呤作用有关。小鼠实验表明腹腔内注射PAP可以降低至死量病毒感染造成的死亡。感染致死量病毒病毒前或后注射PAP小鼠的存活率分别为87.5％或85.7％。
　　GRFT和PAP具有抑制日本脑炎病毒感染的能力，能够保护小鼠免受病毒感染。