研究背景和目的肝移植是多种终末期肝病唯一有效的治疗方法,但是随着肝病患者数量的不断增加,移植等待名单上患者数量也在不断的增长,同时供体肝脏的数量短缺,供受体间的矛盾日益突出。在中国的法律法规下,心脏死亡供体(DCD)成为供体肝脏主体的趋势越来越明显。DCD供体肝脏在移植过程中经历了热缺血、冷保存和再灌注三个阶段。DCD供肝较传统途径获取的供体肝脏有着明显的差别,这类供体肝脏经历较长时间的热缺血过程,且热缺血时间难以控制,术后供体肝脏功能恢复缓慢甚至移植肝失功的发生率大大增加。随后的冷保存和再灌注过程人为可控,同时也是损伤的关键,对器官功能有着重要的影响。冷保存阶段细胞功能衰竭、能量供给障碍都会降低器官功能,并对下一步的再灌注产生极大的影响。再灌注阶段的损伤机制复杂,主要有氧自由基损伤、钙超载、中性粒细胞集聚损伤、炎性因子、线粒体失功等,各种损伤因素之间相互联系相互影响。近年来,随着在亚细胞层面上对冷保存-再灌注损伤机制的研究,细胞器线粒体在损伤中所起的作用越来越受到重视。线粒体是氧化磷酸化和能量产生的主要场所,线粒体失功能够对冷保存和再灌注阶段都产生不利的影响。冷保存阶段的线粒体功能损害会引起肝脏细胞能量合成障碍,加重细胞水肿和凋亡;而再灌注时失功的线粒体会引起氧化应激反应加重,损害严重的线粒体再灌注后功能将难以恢复,另外,损伤线粒体可在再灌注初期产生少量ROS并进一步引发灌注后期ROS的爆发产生。器官保存液的发明对器官移植技术的发展提供了巨大的推动作用,而其发挥作用的阶段主要在冷保存阶段,通过保护冷保存阶段细胞的功能,减少细胞肿胀坏死和能量耗竭等,并进一步减轻再灌注过程中的损伤因素,最终减轻移植器官失功。UW液一直是器官保存的“金标准”,随着对器官保存机制的研究和认识的深入,人们通过改变UW液的成分来达到进一步提高保存效率的目的,并取得了良好的效果。对器官保存液中有效成分进一步改进,从而使之对供体器官起到更有效的保护作用,成为近年来器官移植研究领域一大热点问题。甲烷(Methane)是一种无色、无味、可燃性气体。是一种单纯性的窒息性气体,但是本身并没有毒性。甲烷在大气中含量丰富,由于其具有可燃性,常常被用作燃料。随着对甲烷理化性质研究的深入,人们慢慢认识到它在医疗领域的价值。研究发现,甲烷能够加强小肠蠕动幅度,增加小肠收缩能力。Boros证实甲烷能够减轻肠道的缺血再灌注损伤,而这一作用是通过其具有的抗氧化、抗炎作用实现的。在另外一项研究中,通过富含甲烷的生理盐水注射到大鼠体内以减轻大鼠肝脏的缺血再灌注损伤。甲烷本身具有良好的还原性,在机体的氧化还原平衡中,甲烷也具有重要的作用,研究证实,在乏氧的情况下,线粒体能够产生甲烷对抗过剩的过氧化物以减轻过氧化物对线粒体的损伤。同时有明确的研究显示吸入甲烷能够减轻再灌注过程中线粒体电子传递链的损伤,这表明甲烷对线粒体有重要的保护作用。我们假想,能否在冷保存阶段加入甲烷,减轻冷保存阶段的线粒体损伤,并进一步减轻再灌注损伤。本课题采用SD大鼠肝脏移植模型,研究在冷保存和再灌注两个过程中,甲烷对供体肝脏损伤及线粒体功能的影响,揭示甲烷在冷保存-再灌注过程中的保护作用及其机制。研究方法及结果第一部分甲烷对冷保存阶段DCD供体肝脏线粒体功能的影响1、冷保存阶段甲烷对肝脏HE染色结果的影响;我们通过人为模拟的DCD供体肝脏模型,将DCD供体肝脏冷保存4小时后,进行HE染色,观察DCD供体肝脏形态学变化。可以明显观察到添加了甲烷的UW液保存后的DCD供体肝脏细胞损伤和形态学改变均较普通UW保存的肝脏明显减轻。2、冷保存阶段甲烷对线粒体呼吸控制率(RCR)和线粒体磷氧比(ADP/O)的影响;我们将经历了冷保存的DCD肝脏通过差速离心的方法提纯肝脏细胞内线粒体,并使用Clark氧化电极检测经保存后的线粒体RCR及相应的ADP/O,发现经富含甲烷的UW液保存处理后线粒体的功能相对于普通UW液保存处理的肝脏线粒体显著提高。3、冷保存阶段甲烷对线粒体产生ATP功能的影响;为了进一步了解冷保存后各组线粒体功能的差别,我们使用ELISA试剂盒检测肝脏组织内的ATP水平。结果显示含甲烷的UW液保存组的肝脏组织ATP含量高于普通UW液组。第二部分甲烷对再灌注阶段DCD供体肝脏线粒体及肝脏损伤的影响1、再灌注阶段甲烷对DCD供体肝脏形态学改变的影响;经历过冷保存阶段的肝脏行移植后将立即进入再灌注阶段,为了验证含有甲烷的UW液保存后的DCD肝脏是否能够更好的耐受再灌注损伤,我们通过HE染色首先观察肝脏细胞形态学改变的差异。可以看出,经过含甲烷的UW液冷保存4小时后的DCD供体肝脏在血流复灌6小时后,肝脏细胞的损伤较移植前显著加重,但是相比较于经过同样处理的普通UW液保存的肝脏细胞损伤却明显减轻。2、再灌注阶段甲烷对DCD供体肝脏细胞凋亡的影响;我们通过TUNEL染色的方法检测了移植肝脏再灌注后各组肝脏细胞的凋亡情况,发现含甲烷的UW液组的DCD供体保存组肝脏凋亡细胞比例较普通UW液保存组显著降低。3、再灌注阶段甲烷对DCD供体肝脏功能指标ALT/AST的影响;为了进一步了解各组肝脏在复灌再灌注后的损伤情况,我们通过生化分析仪检测肝脏损伤指标ALT和AST的水平。通过研究发现,经过甲烷保存处理的DCD肝脏损伤指标显著降低。4、再灌注阶段甲烷对DCD供体肝脏纯化线粒体呼吸控制率(RCR)及磷氧比(ADP/O)的影响;我们之前的研究已经简单说明了在冷保存阶段甲烷能够减轻线粒体功能的损伤,为了进一步了解再灌注过程中线粒体功能损伤和氧化应激的情况,我们通过Clark氧化电极法检测了各组DCD肝脏线粒体功能指标RCR和ADP/O。这里我们观察到经过含甲烷的UW液保存处理的DCD肝脏线粒体功能损伤较普通UW液组线粒体功能损伤减轻。5、再灌注阶段甲烷对DCD供体肝脏线粒体产生ATP的影响;线粒体的主要功能是为氧化磷酸化提供场所,同时产生ATP,为了进一步明确各组线粒体功能的差别,我们通过ELISA试剂盒检测了再灌注6小时后的供肝肝脏组织ATP水平,结果显示含甲烷的UW液保存的DCD肝脏内ATP水平相比于普通UW液组高。6、再灌注阶段甲烷对DCD供体肝脏氧化应激指标(MDA、SOD、ROS、GSH)的影响。相关研究显示甲烷具有良好的抗氧化作用,根据我们的假想,甲烷能够发挥抗氧化作用是通过减轻线粒体在冷保存和再灌注过程中的损伤,从而引起氧化应激减轻。我们通过相应的检测试剂盒检测了再灌注后肝脏氧化应激的相关指标(MDA、SOD、ROS、GSH)。结果显示,使用含甲烷的UW液保存后的DCD肝脏经历再灌注损伤后,相关的氧化应激指标均有效减少,这和线粒体功能指标的变化一致。7、甲烷对移植后大鼠生存率和生存时间的影响;通过改良UW成分的最终目的是要优化供体肝脏质量。我们通过建立大鼠肝移植模型以观察各组肝脏在体情况下功能恢复的情况。结果显示使用了含甲烷的UW液处理的DCD肝脏能够延长移植后大鼠的生存时间和生存率。结论我们的研究通过建立人为模拟的DCD供体肝脏模型和大鼠肝移植模型研究甲烷对DCD供肝在冷保存-再灌注过程中的保护作用,同时进一步证实其保护作用是通过减轻冷保存阶段线粒体功能损伤,减轻再灌注损伤,提高移植大鼠生存时间。