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目的:通过基因工程修饰树突状细胞(Dendritic cells,DCs),构建hIL-10和hFasl重组质粒,探讨hIL-10和hFasl单个和联合修饰DCs在体外抑制免疫排斥反应的效果。同时通过构建大鼠肝移植急性排斥动物模型,进一步研究单个和联合修饰后的DCs对大鼠肝脏移植后的排斥反应和存活时间的影响,探讨其在诱导免疫耐受的机制,为今后临床肝脏移植免疫耐受治疗提供新的策略。方法:1、大鼠骨髓来源的DCs的培养及鉴定:用低剂量的细胞因子(集落刺激因子以及IL-4)诱导培养大鼠骨髓来源的造血前体细胞分化为成熟树突状细胞(mature dendritic cells,mDCs)和未成熟的树突状细胞(immature dendritic cells,imDCs),利用倒置显微镜等对细胞进行形态学观察,并用流式细胞法以及免疫荧光法对其进行表型鉴定,利用混合淋巴细胞法对其进行功能学鉴定。2、构建PCDH-CMV-EGFP-hIL-10以及PCDH-CMV-EGFP-hFasl慢病毒表达载体:(1)PCR扩增hIL-10以及hFasl基因后并用1%琼脂糖凝胶分离、回收PCR扩增产物后与PCDH-CMV-EGFP空载体一起用EcoR1以及BamH1进行双酶切,T4DNA连接酶连接过夜,将产物转入DH5α感受态细胞内;(2)挑取单克隆菌落扩增后进行菌落PCR以及质粒抽提,将提取的质粒进行酶切验证,验证阳性的质粒送公司测序;(3)选取细胞状态良好的293T细胞按照慢病毒包装体系进行慢病毒的包装、浓缩,浓缩后的病毒颗粒于-80℃保存。3、慢病毒介导的PCDH-CMV-EGFP-hIL-10、PCDH-CMV-EGFP-hFasl单个以及联合感染imDCs,检测感染后imDCs的分子表型以及其免疫学功能的变化:(1)ELISA、Western-blot检测感染后细胞的IL-10及Fasl的表达情况;(2)流式细胞术检测感染后的imDCs表面CD80、CD86以及MHC-II分子的表达情况;(3)混合淋巴细胞反应法检测感染后的imDCs对T细胞的增殖作用;(4)ELISA检测混合淋巴细胞后上清里面TGF-β1以及TNF-α的变化。4、大鼠肝脏移植急性排斥动物模型的建立:采用改良二袖套法用Lewis作为供鼠,BN作为受鼠建立大鼠肝脏移植急性排斥模型。5、PCDH-CMV-EGFP-hIL-10以及PCDH-CMV-EGFP-hFasl单基因以及联合基因感染后的DCs输注对于诱导肝移植后免疫耐受的研究:(1)移植后肝脏苏木精-伊红染色(HE)以及急性免疫排斥反应的病理评分(RAI);(2)观察各组大鼠术后的生存时间。结果:1、DCs的培养及鉴定:(1)倒置显微镜观察细胞形态显示DCs形态不规则,胞核空亮,周围有突起;(2)流式细胞法及免疫荧光实验显示mDCs较imDCs高表达CD80、CD86以及MHC-II分子;(3)混合淋巴细胞实验证实mDCs对淋巴细胞有明显的促增殖作用,而imDCs的促增殖作用较弱。2、PCDH-CMV-EGFP-hIL-10以及PCDH-CMV-EGFP-hFasl真核表达质粒的构建、筛选、鉴定、扩增以及抽提:(1)琼脂糖凝胶电泳结果显示PCR产物大小与目的基因大小一致;(2)菌落PCR显示连接后的质粒成功导入目的基因片段;(3)重组质粒经双酶切验证后都有两条条带,大小也与目的基因大小一致;(4)双酶切阳性的重组质粒测序后的结果经Genbank比对后基因序列完全正确。3、慢病毒介导的PCDH-CMV-EGFP-hIL-10、PCDH-CMV-EGFP-hFasl单个以及联合感染imDCs,检测感染后imDCs的分子表型以及其免疫学功能的变化:(1)ELISA检测转染后各组上清目的蛋白的表达,发现IL-10组以及联合感染组细胞上清里IL-10的表达均高于其它组,而FasL组以及联合感染组细胞上清里sFasl的表达与其它组差异无统计学意义;(2)Western-blot显示单基因以及双基因联合感染组均有相应的目的蛋白的高表达,空载体组能够低表达IL-10蛋白,未见明显的Fasl蛋白的表达;(3)流式细胞法证实基因感染后并未明显影响imDCs表面CD80、CD86以及MHC-II分子的表达;(4)混合淋巴细胞实验证实单基因感染组对淋巴细胞的增殖反应均弱于imDCs组以及mDCs组,双基因联合感染组对淋巴细胞的增殖反应弱于单基因感染组;(5)感染后DCs与淋巴细胞混合后上清中TGF-β1显示双基因转染组上清中TGF-β1的含量较单基因组略高,IL-10组上清液中TGF-β1含量较Fasl组略高,而Fasl组上清液中TGF-β1含量较mDCs组略高,与imDCs组以及空载体组差异无统计学意义;TNF-α的ELISA检测结果显示双基因感染组上清液中TNF-α含量较Fasl组、空载体组、imDCs组以及mDCs组略低,而与IL-10组差异无统计学意义,Fasl组mDCs组略低,与imDCs组、空载体组差异无统计学意义。4、大鼠肝脏移植急性排斥模型的建立:利用改良二袖套法成功构建了Lewis-BN大鼠肝脏移植急性排斥模型。5、PCDH-CMV-EGFP-hIL-10以及PCDH-CMV-EGFP-hFasl单基因、联合基因感染后的DCs输注对于同种异体肝移植后免疫耐受的研究:移植术后大鼠肝脏病理示双基因修饰组以及IL-10修饰组仅有少量淋巴细胞浸润,RAI评分约为2-4分,属于非确定型急性排斥反应到轻度排斥反应之间;Fasl组汇管区大部扩张,中量淋巴细胞浸润,RAI评分约为4-5分,属于轻-中度排斥反应;imDCs组及空载体组汇管区见中量淋巴细胞浸润,大部分胆管上皮破坏,RAI评分约为5-6分,属于中度排斥反应;mDCs组及未加DCs干预组表现为重度汇管区炎,大部分胆管上皮破坏、变性,RAI评分约为9分,属于重度排斥反应。结论:1、本实验利用大鼠骨髓造血干细胞在体外成功诱导和培养出足够数量的mDCs以及imDCs。2、成功构建了PCDH-CMV-EGFP-hIL-10以及PCDH-CMV-EGFP-hFasl慢病毒表达载体,并成功感染imDCs,获得较好的感染效率。同时,转入的基因可在imDC细胞中稳定表达。3、本实验通过hIL-10与hFasl双基因共修饰imDCs后,在体外诱导免疫耐受的能力明显高于单基因感染以及未感染组,说明联合应用hIL-10与hFasl在诱导移植免疫耐受的研究有很好的前景。4、本实验利用二袖套法以Lewis大鼠作为供体,BN大鼠作为受体成功构建大鼠肝脏移植排斥反应模型。5、单基因修饰以及双基因共修饰后的imDCs在体内均能抑制急性排斥反应,并且双基因修饰组优于单基因修饰组。