β-胡萝卜素具有多种生理功能和生物活性,广泛应用于医药、食品添加剂、化妆品、保健品等领域。随着β-胡萝卜素代谢路径研究的不断深入,构建合成β-胡萝卜素的细胞工厂十分必要。本论文将来自成团泛菌P.agglomerans的基因簇crt EYIB引入大肠杆菌,构建出生产β-胡萝卜素的大肠杆菌基因工程菌,并从提高前体物、减少副产物以及优化代谢路径等方面出发,结合计算工程,获得一系列高产β-胡萝卜素的基因工程菌株,为大量生产β-胡萝卜素提供新的策略,本研究得到的主要结论如下:(1)敲除硫酯酶基因对MEP前体物丙酮酸的影响本文根据实验室已有的敲除合成脂肪酸相关基因(tes A、tes B、tes C)的菌株,即利用大肠杆菌无痕编辑方法——TRAGE(Tandem repeat assisted genome editing),对相关菌株进行单敲除、双敲除、三敲除等操作,减少脂肪酸代谢路径对丙酮酸的消耗,使糖酵解产生的丙酮酸尽可能多地走向β-胡萝卜素合成方向。实验结果证明,MGKC、MGKCB和MGKCBA菌株对丙酮酸的积累量较高且三者相差不多,在此基础上,引入β-胡萝卜素外源基因——crt EYIB,WY006相比于出发菌株WY001提高了7倍,同时,WY006的乙酸含量最低。(2)敲除副产物乙酸合成基因在WY006的基础上,敲除副产物乙酸合成相关基因——磷酸乙酰转移酶基因(pta)和乙酸激酶基因(ack A)、丙酮酸氧化酶基因(pox B),获得MGL1和WY010,后者乙酸含量明显低于前者为1.28 g/L,所得到的菌株WY011β-胡萝卜素产量为4.46 mg/L,相比于WY001提高11倍。(3)利用RBS Calculator对MEP途径和β-胡萝卜素合成路径相关基因进行RBS优化在菌株WY010的基础上重点对2-甲基-D-赤藻糖醇-4-磷酸(MEP)途经以及β-胡萝卜素合成途径进行基因改造。本文利用生物物理模型RBS Calculator辅助设计该代谢路径上相关基因的核糖体结合位点序列,同时结合TRAGE的方法完成了对MEP途径上限速基因dxs、idi,关键基因isp E、isp A、isp H的RBS改造,发酵结果显示Isp H的增强对β-胡萝卜素的产量造成不利影响。发酵得到β-胡萝卜素最高产量的菌株WY076为31.24 mg/L,随后对β-胡萝卜素合成路径上各基因crt E、crt Y、crt I、crt B分别进行RBS优化,获得WY077产量为38.18 mg/L,优化发酵条件得到最终产量为38.85 mg/L,而只含有β-胡萝卜素外源基因而没有作任何基因改造的原始工程菌株WY001β-胡萝卜素的含量仅为0.4 mg/L。补料分批发酵73 h得到β-胡萝卜素439.26 mg/L。