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葡萄糖、蛋白质和脂肪的三大代谢是哺乳动物细胞获得能量的主要方式。其中正常组织主要是依靠葡萄糖通过糖酵解途径提供能量,糖酵解途径中产生的中间代谢产物能够为蛋白质代谢和脂肪代谢的相关途径提供原材料,使得三大代谢途径能够紧密地联系起来。糖酵解途径一共有十个反应,其中存在三个关键调控步骤,己糖激酶、磷酸果糖激酶和丙酮酸激酶是调控步骤中的三个关键酶。在氧气充足的情况下葡萄糖有氧氧化产生的丙酮酸经过氧化脱羧形成乙酰辅酶A将最终进入三羧酸循环提供能量。在缺氧的条件下,丙酮酸通过糖酵解途径最终被氧化为乳酸,这就是正常组织的无氧糖酵解途径。而上世纪20年代德国生物学家Otto Warburg发现肿瘤细胞在有氧条件下会利用葡萄糖进行糖酵解反应并产生大量的乳酸作为主要的代谢途径,该有氧糖酵解现象被称为Warburg效应。己糖激酶(Hexokinase, HK)是糖酵解途径中的首个限速关键酶。在哺乳类动物体内,己糖激酶存在有四种亚型(HK1, HK2, HK3和HK4),而在肿瘤细胞中主要为己糖激酶2型(HK2)蛋白并且过度表达。蛋白质的O-GlcNAc糖基化修饰在细胞生命活动中扮演着重要的调控作用。O-GlcNAc糖基化的修饰异常能够导致肿瘤、糖尿病、心脏病与阿尔茨海默病等多种神经退行性病变疾病的发生。本课题的研究目的就是鉴定HK2是否是o-GlcNAc糖基化蛋白质以及确定其糖基化位点,并且构建内源性HK2基因敲除的细胞株,为研究HK2的O-GlcNAc糖基化在肿瘤细胞中的生物学功能作用奠定基础。本课题首先通过免疫共沉淀技术证实HK2是o-GlcNAc糖基化的蛋白质,然后通过质谱分析鉴定HK2糖基化的位点。质谱分析的HK2糖基化的样本来自于体外标记,其具体方法如下：通过构建原核表达系统,利用大肠杆菌表达HK2以及OGT蛋白,经过亲和层析纯化获得HK2和OGT蛋白,在体外对HK2蛋白进行O-GlcNAc糖基化标记,运用质谱分析的方法对HK2的O-GlcNAc糖基化位点进行初步鉴定,结果检测到5个o-GlcNAc糖基化信号,这5个糖基化位点分别是S32、 T331、 T336、 S340和T762。由于O-GlcNAc是单糖修饰并且易水解的特点,其糖基化位点的鉴定方法有待完善提高,本课题质谱分析获得的5个潜在糖基化位点可能存在假阳性,需要使用其它方法确认在细胞内HK2的O-GlcNAc糖基化的真实位点,为此,我们分别构建了HK2o-GlcNAc糖基化修饰位点突变的真核表达载体,这5个HK2突变的表达载体分别为p3xFLAG-CMV-10/HK2/S32A 、 p3xFLAG-CMV-10/HK2/T331 A p3xFLAG-CMV-10/HK2/T336A、 p3xFLAG-CMV-10/HK2/S340A以及p3xFLAG-CMV-10/HK2A762 A,用脂质体Lipofectamin 2000将这样的系列载体转染至293T细胞,通过免疫共沉淀进一步确定在细胞内HK2的O-GlcNAc糖基化修饰的真正位点,目前实验还在进行之中。为了研究HK2糖基化位点的功能,需要获得内源性HK2基因敲除的稳定细胞株。近几年,随着生物学的相关研究技术的发展,一种能够对目的基因进行定点编辑改造的基因修饰技术--CRISPR/Cas9技术(Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats/Cas9)为基因组的修饰提供了一种新的思路。CRISPR/Cas9技术是相比于锌指核酸内切酶(zinc finger nuc leases, ZFNs)和转录激活因子样效应物核酸酶(transcription activatorl ike effector nuc lease, Talens)技术更具有优势、操作更简便更灵敏的第三代人工核酸内切酶技术。本研究采用CRISPR/Cas9技术对内源性HK2基因进行敲除,首先试验设计了HK2-A、HK2-B和HK2-C共3组特异靶向HK2基因的靶位点,通过酶切连接的方法插入到CRISPR/Cas9骨架载体中并对其测序验证,将构建的载体lentiCRISPRv2/HK2-A, lentiCRISPRv2/HK2-B和lentiCRISPRv2/HK2-C分别转染到细胞内,提取基因组DNA并对其进行PCR扩增目的片段,通过T7E1酶切实验评估敲除的效率。结果表明靶向序列HK2-C具有较高的突变效率,然后使用含有靶向序列HK2-C的载体转染细胞,运用有限稀释和加药筛选的方法获得HK2基因敲除的稳定MDA-MB-231细胞株,采用western blotting检测方式对敲除效果进行了鉴定,确认获得了2株HK2基因敲除的单克隆细胞,为进一步深入研究HK2的O-GlcNAc糖基化修饰对Warburg效应的功能作用奠定了基础。