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抑郁症作为一种精神性疾病已经对人类健康构成严重威胁。帕罗西汀(Paroxetine,PRX)是第二代抗抑郁药,是选择性5-羟色胺再摄取抑制剂(Selective serotonin reuptake inhibitors,SSRI)的代表药。PRX口服给药存在明显的首过效应,生物利用度不到50%。抑郁症患者在使用PRX过程中会发生耐药现象,最终发展成难治性抑郁(Treatment resistant depression,TRD)。TRD的发生机制尚不明确。由于血脑屏障(Blood-brain barrier,BBB)上的ABC外排转运体影响多数中枢神经系统(Central nervous system,CNS)药物的疗效,我们推测ABC外排转运体介导的外排作用与TRD的产生有关。因此,本文考察BBB上主要外排转运体P-糖蛋白(P-glycoprotein,P-gp)和乳腺癌耐药蛋白(Breast cancer resistance protein,BCRP)对PRX透过BBB进入CNS的影响,从转运体水平阐述抑郁症发生耐药的可能机制。我们分别采用转染细胞、小鼠脑毛细血管内皮细胞(Brain capillary endothelial cell,BCEC)、小鼠原位脑灌注以及整体动物模型研究P-gp与/或BCRP在PRX细胞摄取与跨BBB转运中的作用,评价P-gp与BCRP介导的药物外排作用是否与抑郁症的耐药存在潜在联系。此外,我们进一步利用小鼠悬尾实验(Tail suspension test,TST)考察P-gp与BCRP对PRX药效的影响,从药效学水平阐述外排转运体P-gp与BCRP在PRX发挥抗抑郁疗效中的作用。本文建立了PRX在不同基质中的高效液相-荧光检测(High performance liquid chromatography-fluorescence,HPLC-FLU)的定量分析方法。选择普萘洛尔为内标,血浆与脑匀浆样品以乙酸乙酯作为萃取剂进行液液萃取预处理,细胞样品或透析液样品用甲醇沉淀或稀释。采用Eurospher 100-5 C18色谱柱,流动相为乙腈-0.5%三乙胺水溶液(v/v,35:65,磷酸调p H 3.5),激发与发射波长为295 nm和350nm,分析时长8 min。方法学验证结果表明该方法专属性高,精密度和准确度良好,不同基质中的PRX在5-500 ng/m L浓度范围内线性良好,不同条件下的稳定性偏差均满足生物样品定量分析指导原则的相关要求。因此,本文建立的PRX HPLC-FLU方法准确、灵敏,可满足PRX体内、体外实验研究的定量分析要求。本文首先采用高表达P-gp及BCRP的细胞研究外排转运体P-gp与BCRP对PRX摄取产生的影响。时间依赖性与浓度依赖性实验结果表明,PRX跨膜转运过程具有饱和性,符合非线性动力学特征,且PRX在P-gp转染细胞中摄取量明显少于空载体组,提示PRX为P-gp底物,抑制剂维拉帕米和Cs A可以显著增加PRX在MDCK-MDR1细胞中的摄取量,说明P-gp限制了PRX的摄取过程。但BCRP抑制剂泮托拉唑和Ko143对PRX在MDCK-BCRP细胞中的摄取无影响,提示BCRP对PRX跨BBB转运不产生影响。此外,由于P-gp与BCRP在BCEC上表达水平较高,本文采用小鼠BCEC作为另一体外模型研究PRX跨BBB转运机制。时间与浓度依赖性实验结果表明,PRX在小鼠BCEC上的摄取随着时间及药物浓度增加呈现非线性过程。维拉帕米及Cs A可以使PRX在BCEC的药物外排量减少,细胞内药物残余量升高,而泮托拉唑不改变PRX在BCEC中的摄取及外排量,提示P-gp介导的外排机制在PRX跨BBB转运中发挥重要作用。为了进一步研究PRX在体内跨BBB转运机制,本文还采用小鼠原位脑灌注与整体动物药动学-脑组织分布模型研究P-gp和BCRP对PRX跨BBB以及脑靶向分布的影响。小鼠原位脑灌注实验结果表明,不同灌注时间及灌注浓度下PRX在小鼠脑内的分布容积及转运系数均呈现良好的线性关系。维拉帕米和Cs A可明显增大PRX的脑表观分布容积与转运系数,而BCRP抑制剂泮托拉唑对PRX的脑分布与转运系数无明显影响,说明仅P-gp阻碍PRX跨BBB转运。整体动物药动学-脑组织分布模型考察不同抑制剂维拉帕米、Cs A及泮托拉唑对PRX在小鼠血浆与脑组织暴露量的影响。结果表明,维拉帕米与Cs A能显著升高小鼠脑内PRX浓度,但血浆药物浓度不改变或仅略微升高。采用脑-血浆药物浓度比来扣除血药物浓度的影响,维拉帕米和Cs A显著增高脑-血浆药物浓度比,而泮托拉唑无此作用。由于靶组织或靶器官中只有游离药物才能发挥药效,因此蛋白结合率也是影响药效的重要作用。本文采用平衡透析法测PRX汀在小鼠血浆及脑组织中的蛋白结合率。结果表明,PRX在小鼠血浆中的蛋白结合率约为95%,而在脑组织中的蛋白结合率高于99%,是一极高蛋白结合药物。以蛋白结合率为依据计算游离药物浓度,维拉帕米与Cs A可明显提高脑组织中游离的PRX浓度,而泮托拉唑组没有类似影响。最后,本文TST研究P-gp与BCRP对PRX药效的影响。考察小鼠在6 min内的不动时间作为药效指标,并用旷场实验(Open field test,OFT)考察PRX及抑制剂对小鼠自发活动性的影响,以排除TST中可能的假阳性结果。结果发现,PRX及抑制剂对小鼠自身的活动状态无影响;PRX能缩短小鼠的不动时间;而PRX与维拉帕米或Cs A合用时比PRX单用时的作用更为显著,泮托拉唑与PRX合用的作用与PRX单用类似。同时,我们测定脑组织不同部位以及血浆中PRX的浓度水平,维拉帕米和Cs A预处理后的小鼠各个脑部位药物浓度均明显升高,但血浆中药物浓度维持不变,提示抑制BBB上P-gp的功能可提高PRX的脑暴露量从而增强药效,而抑制BCRP未观察到显著性的改善。综上所述,本文研究P-gp与BCRP介导的PRX跨BBB转运机制。我们发现P-gp是介导PRX外排的主要转运体,BCRP几乎不发挥作用。P-gp抑制剂维拉帕米与Cs A可增加PRX的脑内分布从而提高药效,为TRD的治疗提供可能的新方法。