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本实验菌种spMF0507是产DHase和DCase的野生菌,而DHase活力远远大于DCase,因此可以通过控制适当pH值,使DCase失活,而保留DHase活力生产NC-D-pHPG。此外还有一菌种Espf7是克隆了DCase基因的大肠杆菌,它能表达DCase活性继续将NC-D-pHPG转化为D-pHPG,可DCase是胞内酶,故需要对其进行细胞破碎才能释放出酶。另外利用正交法对spMF0507的培养基组成和发酵培养条件也进行了研究,之后把发酵优化结果投入5升发酵罐进行验证。最后对工程菌Espf7发酵后提取的酶进行了固定化研究,通过测定蛋白质含量和酶活力来确定固定化结果。以下是整个实验结果:
(1)菌种spMF0507的适宜接种龄是20~24h,pH值控制在9.0~9.5时,可以使DCase失活,DHase活力仍有0.2u·mL-1,在该条件下来制备NC-D-pHPG。但转化过程中,NC-D-pHPG容易被氧化成红色物质,而通氮气能防止其被氧化。提取NC-D-pHPG时加入2%的丙酮能加快结晶速度,结晶率达到97.9%,NC-D-pHPG的纯度达98.5%。
(2)基因工程菌Espf7在0.02%的氯仿用量下可以通透细胞膜,适宜接种龄为16~20h,接种量2%,初始pH值7.0,培养温度30℃,阿拉伯糖0.01%;甘油0.30%;玉米浆3%;NaCL0.2%;KH2PO40.05%;MgSO40.05%;MnCL20.02%;CoCL20.01%,使DCase活力由1.12u·mL-1提高到2.1u·mL-1,提高了87.5%。在发酵罐上控制条件温度30℃、转速500r/min,pH设定在7.0来补料,结果活力提高到3u·mL-1。
(3)均质机破碎细胞的最佳条件为:压力控制在70MPa,破碎时间15min。以TJS环氧基树脂作为固定载体,最适固定化条件为:TJS用量1g对应133u酶活,固定时间15h,温度28℃,pH值7.5最后固定化酶活为58u·g-1,蛋白固定率可达98%,酶活回收率达到49.3%。国产载体与进口载体固定化相比较:国外固定化酶活力比国内高3u·g-1,但国产的半衰期为35批,而国外为25批,明显国内的固定化酶较稳定。