戊型肝炎（Hepatitis E,HE）是由戊型肝炎病毒（Hepatitis E virus,HEV）引起的病毒性肝炎,是一种急性、自限性的人畜共患疾病,兔是HEV自然状态下的主要储存宿主,兔HEV属基因3型,能够通过水源和食物传染给其他动物,进而传播至人类,因此阻断兔HEV的传播对于公共卫生具有重要的意义。HEV包含3个开放性阅读框（Open Reading Frame,ORF）,ORF2编码衣壳蛋白,含有主要的抗原表位,是疫苗研发的主要位点。此外,基于HEV ORF2蛋白截短重组表达的类病毒颗粒（Virus-like particle,VLP）被广泛用于HEV早期入胞过程的研究。其中,基因1型HEV ORF2蛋白的截短重组蛋白p239（368-606 aa）包含着参与病毒吸附、入侵的相关位点,同时,其作为免疫原可诱发机体产生高滴度的抗体。另外,猪HEV sp239（368-606 aa）蛋白成功建立了吸附Hep G 2细胞模型。纳米抗体（Nanobody）是存在于骆驼科动物血清中天然缺失轻链及重链第一个恒定区CH1的重链抗体（Heavy chain-only Antibodies,Hc Abs）,因其大小在纳米尺度,故被称为纳米抗体。纳米抗体具有分子量小（15 k Da）,亲和力强,稳定性高,且易于生产等特性。用抗原免疫骆驼后,通过噬菌体展示技术即可获得与免疫原特异性结合的纳米抗体,其在疾病的检测、诊断及治疗中得到广泛的应用。本实验首先应用原核系统表达兔HEV ORF2 r239蛋白（368-606 aa）并成功建立了r239吸附Hep G 2细胞模型;然后将表达纯化后的r239蛋白免疫骆驼制备了针对r239特异性的纳米抗体,最后体外验证其阻断r239吸附Hep G 2细胞的作用。应用的实验方法及所得结果如下:1.r239纳米抗体的制备与筛选对本实验室保存的r239大肠杆菌表达菌种活化、诱导表达,并利用分子筛对其进行纯化,得到了高纯度包涵体形式的r239,产量60 mg/L。用纯化后的r239免疫双峰驼,每次2 mg,共6次,自第三次免疫后采集骆驼血清检测针对r239的抗体效价,第五次免疫后效价1:10~6,于第六次免疫结束采取双峰驼外周血并分离淋巴细胞,提取细胞总RNA,反转录后扩增VHH基因,构建噬菌体重组抗体展示文库,库容量3.5×10~8pfu/m L。通过噬菌体展示技术筛选针对r239特异性的纳米抗体,并测定其基因序列,最终获得11株抗r239的纳米抗体。2.r239纳米抗体的原核表达,纯化及功能验证从筛选到的纳米抗体中选择4株对r239蛋白高亲和力的构建至p ET21b原核表达载体内进行重组表达,并通过亲和层析对其纯化。SDS-PAGE,Western blot与间接ELISA实验表明,获得的r239纳米抗体纯度高,特异性强。3.r239吸附Hep G 2细胞蛋白浓度的确定使用不同浓度的r239进行吸附实验,确定不同检测方法下（Western blot、IFA及FCM）r239吸附Hep G 2细胞的最适浓度,经鉴定,r239可吸附并进入Hep G 2细胞,在Western blot中,最适浓度为2μmmol/m L;在IFA与FCM中,最适浓度为0.4μmmol/m L,作为下一步阻断实验的基础。4.纳米抗体阻断r239吸附Hep G 2细胞实验将4株纯化后的r239特异性纳米抗体（Nb12、Nb47、Nb60与Nb80）与r239在上述确定好的最适浓度下混合,纳米抗体终浓度为25μmmol/m L,兔HEV阳性血清（1:100）作为阳性对照,Nb-PEDV（针对PEDV N蛋白的纳米抗体）作为无关纳米抗体对照。Western bot及IFA鉴定中,混合物与Hep G 2细胞于4℃孵育1 h;FCM鉴定中于4℃孵育过夜,检测纳米抗体能否阻断r239吸附Hep G 2细胞。结果表明,Nb47与Nb60均可阻断r239吸附Hep G 2细胞,提示其识别表位与r239吸附细胞相关,表明纳米抗体Nb47与Nb60可能具有抗病毒中和作用。综上所述,本实验建立了兔HEV r239蛋白吸附Hep G 2细胞模型,表达纯化了4株抗r239纳米抗体,并验证了其中三株纳米抗体Nb12,Nb47与Nb60均可在体外部分阻断r239对Hep G 2细胞的吸附。兔HEV r239纳米抗体的制备,对于抗HEV低免疫原性纳米抗体疫苗的制备和疾病防控与治疗提供了思路。