目前缺血性心脏病已成为人类发病率和死亡率最高的疾病之一，其发病原因大多数是与年龄、肥胖、糖尿病、高血压、高血脂及遗传等易患因素相关。临床上对于缺血性心脏病的治疗主要是通过减少心肌氧耗、抑制心肌细胞凋亡、增加冠脉血流和实施血运重建，从而来改善心肌缺血。目前对于心肌缺血病理生理学的研究发现，活性氧在心肌细胞损伤过程中起到了关键性调控作用，多种基因、转录因子以及氧敏感因子信号途径都可能参与了ROS介导的心肌细胞损伤。凋亡也被称为程序化细胞死亡，分为内源性凋亡和外源性凋亡两条途径。外源性凋亡通过激活胞膜上的死亡受体介导的，包括Fas、肿瘤坏死因子（TNF）和TNF相关配体。而内源性凋亡主要是通过调节Bcl-2蛋白家族诱导的，包括Bax、Bak、Bcl-2和Bcl-XL等信号蛋白。而Bcl-2蛋白是内源性凋亡级联反应的关键调控因子，它通过维持线粒体膜的稳定性抑制凋亡，很多凋亡的发生可能是通过抑制Bcl-2蛋白表达诱导的。已经有研究发现Bcl-2蛋白在心肌细胞损伤过程中起到重要的调控作用，但具体的调节机制还不十分清楚。microRNA是近年来发现的一个非编码的小RNA，通过对其靶基因表达的调节，参与了包括细胞增殖、分化、凋亡、衰老等各种生理病理过程。同时，microRNA的生成也受到转录因子和其他因素的调节。在细胞核内，microRNA通过5’端第2-8核苷酸与靶mRNA的3’端非翻译区(untranslated region，UTR)部分序列的配对结合抑制RNA翻译或降解靶microRNA，microRNA在转录后水平调节体内30％以上的mRNA。在心脏的发育分化以及疾病过程中，心肌特异性转录因子自身同样受到复杂的调节，近年来miRNA对其调控作用的研究引起人们普遍的关注。microRNA不仅在心脏发育中起到重要的调控作用，在心肌肥大、心律失常、心肌纤维化、心肌梗死、心力衰竭和心肌细胞凋亡等病理情况下，microRNA也同样发挥重要作用。目前已经有研究发现microRNA与心肌缺血的发生发展密切相关：部分microRNA在缺血的心肌细胞中表达增高，并且其表达水平与心脏缺氧缺血程度相关；还有研究发现在不同心肌缺血部位同一microRNA的表达也有很大差别；进一步研究表明microRNA在缺血再灌注损伤的过程中对细胞凋亡的调控起到重要作用。这些研究提示我们，microRNA在心肌缺血中表达和调控具有多样性和复杂性。最新的研究发现，microRNA-135a在心脏疾病中具有重要的调控作用，microRNA-135a能调控RAAS系统和盐皮质激素受体，并且转染高表达microRNA-135a质粒促进了纤维连接蛋白和胶原蛋白I的表达，在我们工作组前期研究利用microRNA芯片技术检测应激大鼠模型心肌组织差异表达发现，无论是在急性应激还是慢性应激，大鼠心肌组织中microRNA-135a发生显著变化。在肿瘤学的研究中表明，microRNA-135a通过调控不同靶基因参与细胞凋亡通路的调控，从而影响细胞的存活。因此本研究通过用过氧化氢处理大鼠心肌细胞，检测microRNA-135a在氧化损伤过程中的表达，通过分别构建高表达和低表达microRNA-135a质粒，来明确在过氧化氢诱导氧化应激过程中起调控作用，以及其对下游靶基因Bcl-2蛋白的调控作用，从而阐明microRNA-135a对心肌缺血导致细胞凋亡的影响及其作用机制，为临床基因诊断和治疗心肌梗死提供新的靶点。方法(1) MTT法检测H2O2对大鼠心肌细胞H9c2生存率的影响。(2)通过JC-1染色及流式细胞术检测线粒体膜电势的变化；AnnexinV-PI检测细胞凋亡变化。(3) qRT-PCR检测H2O2作用H9c2细胞microRNA-135a RNA基因表达变化。(4)分别转染microRNA-135a mimics质粒和microRNA-135ainhibitor质粒，AnnexinV-PI检测细胞凋亡变化；Western blot方法检测线粒体凋亡相关蛋白Bcl-2、Bax、Caspase-3以及Cleaved Caspase-3的变化。(5)转染si-Bcl-2质粒，qRT-PCR检测H9c2细胞Bcl-2mRNA表达变化；Western blot方法检测Bcl-2蛋白表达变化；同时转染si-Bcl-2质粒和microRNA-135a inhibitor质粒，MTT法检测H9c2细胞生存率变化；AnnexinV-PI检测细胞凋亡变化。结果(1)不同剂量H2O2作用24h能够明显抑制大鼠心肌细胞H9c2的生长，同时选取1mM H2O2作用不同时间，对H9c2细胞亦具有明显的抑制作用。(2) H2O2能够降低心肌细胞H9c2线粒体的膜电势，并诱导心肌细胞凋亡的发生。(3) H2O2明显上调H9c2细胞microRNA-135a RNA表达，并且呈时间和剂量依赖性。(4)进一步检测microRNA-135a在H2O2诱导心肌细胞凋亡过程中的作用及其机制，转染microRNA-135a mimics质粒明显上调心肌细胞中microRNA-135a RNA表达；高表达microRNA-135a加重H2O2对心肌细胞生存率的抑制； microRNA-135a通过抑制Bcl-2蛋白，增加Bax活化和Caspase-3裂解，进而促进H2O2诱导心肌细胞线粒体凋亡途径；高表达microRNA-135a靶向抑制Bcl-2蛋白表达，但不影响Bcl-2mRNA的表达变化。(5)通过转染microRNA-135a inhibitor质粒明显抑制细胞中microRNA-135a RNA表达；抑制microRNA-135a减轻H2O2诱导的心肌细胞损伤，是通过释放对Bcl-2蛋白的抑制，降低Bax蛋白和Caspase-3裂解，从而减少H2O2诱导的心肌细胞凋亡；抑制microRNA-135a对Bcl-2mRNA的表达变化未有明显影响。(6)靶向敲除Bcl-2，其mRNA和蛋白检测Bcl-2均降低；在敲除Bcl-2的心肌细胞中H2O2明显增加心肌细胞凋亡；在敲除Bcl-2同时抑制microRNA-135a的心肌细胞中H2O2对心肌细胞的存活以及凋亡没有明显影响，表明Bcl-2为microRNA-135a的下游靶点，当敲除这个靶点时，microRNA-135a不能发挥其促凋亡的作用，抑制microRNA-135a的表达也不能进一步缓解H2O2诱导的心肌细胞损伤。结论实验结果表明，过氧化氢通过诱导心肌细胞线粒体凋亡途径损伤心肌细胞，在氧化损伤过程中microRNA-135a被激活，microRNA-135a通过靶向作用其下游Bcl-2蛋白进一步加重了H2O2诱导的心肌细胞氧化损伤及细胞线粒体凋亡途径的活化，抑制microRNA-135a可以释放对Bcl-2蛋白的靶向作用，从而减轻了H2O2诱导的心肌细胞氧化损伤，保护心肌细胞。本次研究首次探讨了microRNA-135a在心肌损伤过程中的作用，明确了microRNA-135a其作用的下游靶基因，阐明了microRNA-135a在H2O2诱导心肌细胞凋亡过程中的作用，为临床应用靶向治疗心肌缺氧缺血提供了理论依据。