艾滋病的医学全称是“获得性免疫缺陷综合征”(Acquired ImmunodeficiencySyndrome,AIDS),其病原为“人类免疫缺陷病毒”(Human ImmunodeficiencyVirus,HIV)。自从1982年美国疾病预防控制中心(CDC)第一次为艾滋病命名,世界卫生组织(WHO)就确认口腔念珠菌病是主要的机会性感染之一,并且是HIV感染的重要指标。例如,超过90％的HIV感染者在他们病程中的某些阶段会发生口腔念珠菌病。　　 口腔是全身中分离出念珠菌最多的地方,健康个体中约有31％至55％可以检测到,其定殖率随着疾病的严重程度和住院治疗持续时间的增加而增加。其中白色念珠菌是最普遍的念珠菌病原体,它能侵入所有人体组织,被认为是主要引起免疫功能缺陷患者严重和持续性感染的一种重要病原体。近年流行病学研究还显示,随着免疫抑制剂在临床的广泛使用,以及免疫缺陷人群的增多,尤其是AIDS疫情的蔓延,光滑念珠菌在临床的检出率明显增加,在某些地区光滑念珠菌已成为仅次于白色念珠菌的第2位或第3位的常见念珠菌。在之前的一个研究中,我们收集了82例HIV感染者的口腔含漱液,有60例培养出念珠菌,其中有42例可以分离出白色念珠菌,44例可以分离出光滑念珠菌,同时分离出白色念珠菌和光滑念珠菌的有29例。由此可见,在HIV感染者中,除了主要的白色念珠菌外,光滑念珠菌的检出率也在增高。　　 随着抗真菌药物的频繁应用,念珠菌耐药现象也越来越普遍。氟康唑是一种常用的抗真菌药物。在晚期AIDS患者中,耐氟康唑的念珠菌感染的年发病率约为4.2％,并且是预后差的标志。在传统的抗真菌药产生耐药性后,大量新型抗真菌药物例如阿莫罗芬、萘替芬、特比萘芬、普霉素和伏立康唑等不断问世。尽管目前这些药物在临床上是有效的,可是这些药物的口腔药效学数据非常有限。　　 我们设想,抗真菌后效应(Post-antifungal Effect,PAFE)有可能产生低毒力念珠菌。抗真菌后效应,指的是将真菌暴露于浓度高于最小抑菌浓度(MIC)的某种抗真菌药后,再除去培养基中的药物,在去除抗真菌药物后的一定时间范围内真菌生长受到持续抑制的现象。目前有文献研究抗真菌药对念珠菌是否存在PAFE以及进行PAFE的测定。Minguez对两性霉素、5.氟胞嘧啶、制霉菌素、酮康唑、氟康唑及伊曲康唑等抗真菌药物作用于白色念珠菌产生的PAFE进行研究,实验结果证明两性霉素、5-氟胞嘧啶和制霉菌素对白色念珠菌具有较好的PAFE,而唑类药物只在体外有血清的培养基中才对白色念珠菌具有PAFE。Ellepola等在对10株口腔白色念珠菌分离株的研究发现,制霉菌素、两性霉素B和5-氟胞嘧啶可以观察到明显的PAFE,酮康唑只能观察到一个边缘PAFE值,而氟康唑很少或几乎没有。Ellepola等报道了几个源自口腔的念珠菌种属短暂暴露于制霉菌素后产生数小时PAFE,制霉菌素引发的PAFE平均持续时间最短的是白色念珠菌(6.85 h),最长的是近平滑念珠菌(15.17 h),而克柔念珠菌(11.58h)、热带念珠菌(12.73 h)、光滑念珠菌(8.51 h)分别得到中间值,证实了PAFE同样存在于非白色念珠菌。　　 目前关于念珠菌属PAFE引起的毒力改变的资料很少,PAFE对念珠菌的细胞属性的影响至今还没有被广泛地研究。念珠菌在口腔黏膜定殖和造成感染是一个复杂的过程,主要涉及三个方面:一是宿主的抵抗力,包括机体免疫状况和黏膜损伤等；二是念珠菌与口腔原驻菌之间的相互关系；三是念珠菌自身的毒力水平。而与念珠菌相关的毒力因素主要有粘附性、细胞表面疏水性、与侵入有关的酶、溶血性、菌相转换和表型转换等。细胞表面疏水性是念珠菌一种非特异性的作用力较低的粘附力,也是念珠菌粘附宿主表面的一个互补因子；念珠菌通过粘附来识别定殖；通过利于其侵入的侵袭性酶来破坏黏膜完整性,增强毒力:通过溶血性获得营养；通过形态发生及酵母相和菌丝相之间的菌相转换而使其利于侵入宿主,并对该微生物的适应性有利。　　 HIV感染者口腔白色念珠菌和光滑念珠菌在小剂量氟康唑和特比奈芬的作用下能否产生PAFE是本实验关心的主要问题。此外,抗真菌药物处理之前与之后的PAFE能否引发念珠菌的毒力变化,能否降低念珠菌的毒力,使其致病力下降,这也是值得关注的。因此本文选取HIV感染者口腔白色念珠菌和光滑念珠菌各10株,评估短暂暴露于小剂量的氟康唑和特比奈芬后产生的PAFE情况,并通过研究其对颊黏膜上皮细胞(Human buccal epithelial cell,BEC)的粘附性和胞外磷脂酶活性两个毒力因素,比较使用药物处理并产生:PAFE后引发的念珠菌的毒力变化,来探讨HIV感染者口腔不同念珠菌菌种抗真菌药物的后效应与念珠菌毒力之间的关系。　　 目的:评估HIV感染者口腔白色念珠菌和光滑念珠菌临床分离株短暂暴露于小剂量的氟康唑和特比奈芬后产生的PAFE,从粘附性和胞外磷脂酶活性两个毒力因素研究产生PAFE后念珠菌的毒力变化,探讨HIV感染者口腔不同念珠菌菌种抗真菌药物的后效应与念珠菌毒力之间的关系。　　 方法:从冻存的菌株中挑选10株白色念珠菌和10株光滑念珠菌临床分离株,复苏后保存在沙保培养基中,37℃,培养24h。将氟康唑和特比萘芬分别溶于二甲基亚砜(DMSO)溶液中,配成质量浓度均为12800μg/ml的溶液(特比萘芬药液母液中另按5％比例加入吐温-80),用RPMI1640液体培养基稀释成所需浓度。　　 (1)MIC(最小抑菌浓度)的确定氟康唑和特比奈芬对所有菌株的MIC,按照Mcginnis&Rinaldi的肉汤稀释法来确定。使用1×105cells/ml浓度的接种物两倍连续稀释于96孔板药物中。在37℃中培养24 h后,抑制念珠菌细胞生长的最小药物浓度即为MIC。　　 (2)PAFE分析实验组将0.5ml菌悬液加入含2ml RPMI1640液体培养基和药物溶液的试管中。使用的药物浓度为×4 MIC、×6 MIC和×8 MIC浓度的氟康唑、×2 MIC、×4 MIC和×6 MIC浓度的特比奈芬。对照组将0.5ml菌悬液加入2ml不含药物的RPMI1640液体培养基的试管中。每个试管中的菌悬液浓度为106～107 cells/ml。　　 将试管置于37℃旋转培养箱中,2 h后用无菌PBS离心两次(3000g,10min),以去除药物。然后将上清液完全倒出,沉淀物再悬浮于2.5ml的无菌PBS。在PAFE分析前,对照组和实验组在药物去除后重新进行活菌计数,菌悬液浓度重新配置至106～107cells/ml。　　 每个菌悬液取100μl加入已包含150μl RPMI1640液体培养基的96孔板滴定孔。然后将96孔板放入37℃温箱振荡培养,在念珠菌生长的24 h内,每隔30 min用酶标仪检测培养液的浊度(波长为595nm)。PAFE的持续时间通过使用公式PAFE=T-C来计算,其中T是暴露于药物的菌悬液在去除药物后相对光学密度达到0.05吸光度所需要的时间,C是没有药物的对照组菌悬液相对光学密度达到相同吸光度所需要的时间。　　 (3)念珠菌对BEC的粘附性实验将0.5ml颊黏膜上皮细胞液和0.5ml菌悬液在试管中混匀,37℃振荡培养1h,用12μm聚碳酸酯滤膜的流形滤器在负压下收集BECs,50ml PBS冲洗两次,置于载玻片上晾干,甲醇固定和革兰染色,×400的光学显微镜观察,计算100个颊黏膜细胞上粘附的念珠菌个数。　　 (4)念珠菌的磷脂酶活性实验取菌悬液10μl接种于卵黄平皿表面,放置于室温晾干,37℃培养48 h后,菌落周围形成一明显的沉淀圈即为磷脂酶阳性的指标。磷脂酶活性(Pz值)由菌落的直径与菌落加上沉淀圈的总直径的比率来确定。Pz=菌落直径/总直径。　　 3.结果　　 (1)念珠菌对氟康唑和特比奈芬的PAFE检测结果白色念珠菌的PAFE检测结果:用两样本t检验分别比较暴露于不同浓度的两种抗真菌药物后菌悬液达到0.05吸光度值所用的时间与对照组相比差异是否有统计学意义。在做两样本t检验之前先做方差齐性检验,若方差齐,采用一般t检验；若方差不齐,则采用近似t检验。在×6、×8 MIC浓度的FLU和×4、×6 MIC浓度的TERB中大多数白色念珠菌菌株达到0.05吸光度值所用的时间与未经处理的对照组相比差异有统计学意义(t=-6.169,P=0.000；t=-7.479,P=0.000t=-2.240,p=-0.038;t=-2.615,P=0.018),而×4 MIC浓度的FLU和×2 MIC浓度的TERB与对照组相比差异没有统计学意义(t=-0.604,P=0.554；t=-0.237P=0.815)。　　 光滑念珠菌的PAFE检测结果:光滑念珠菌分离株暴露于不同浓度的两种抗真菌药物后,在×8 MIC浓度的FLU和×4、×6 MIC浓度的TERB中,大多数光滑念珠菌菌株达到0.05吸光度值所用的时间与未经处理的对照组相比差异有统计学意义(t=-3.340,P=0.004；t=-2.446,P=0.025；t=-2.808,P=0.012)。×6浓度的FLU与对照组相比差异没有统计学意义(t=-1.635,P=0.119)。　　 (2)短暂暴露于抗真菌药物后念珠菌对BEC的粘附性结果白色念珠菌的粘附性结果:用两样本t检验比较暴露于药物中的试验组菌株对BECs的粘附性与没有药物暴露的对照组菌株相比差异是否有统计学意义。在做两样本t检验之前先做方差齐性检验,若方差齐,采用一般t检验；若方差不齐,则采用近似t检验。口腔白色念珠菌分离株暴露于×6 MIC浓度的氟康唑和×4MIC浓度的特比蓁芥2h后,所有菌株对BECs的粘附性降低,与没有暴露的对照组相比差异有统计学意义(t=3.881,P=0.001;t=2.642,P=0.017),粘附力减少的平均百分比分别为26.68％和19.48％。　　 光滑念珠菌的粘附性结果:口腔光滑念珠菌分离株暴露于×6 MIC浓度的氟康唑和×4 MIC浓度的特比萘芬2h后,所有菌株对BECs的粘附降低,与对照组相比差异有统计学意义(t=3.223,P=0.005；t=3.580,P=0.002),减少的平均百分比分别为23.14％和27.41％。　　 (3)短暂暴露于抗真菌药物后念珠菌磷脂酶活性结果白色念珠菌的脂酶活性结果:用两样本t检验比较暴露于药物中的试验组菌株的胞外磷脂酶活性与没有药物暴露的对照组菌株相比差异是否有统计学意义。在做两样本t检验之前先做方差齐性检验,若方差齐,采用一般t检验；若方差不齐,则采用近似t检验。口腔白色念珠菌分离株暴露于×4 MIC浓度的特比萘芬2h后所有菌株的细胞外磷脂酶活性降低,与对照组相比差异有统计学意义(下降9.02％,t=-2.231,P=0.04)。暴露于×6 MIC氟康唑的磷脂酶活性与对照组相比差异没有统计学意义(下降5.51％,t=-1.411,P=0.175)。　　 光滑念珠菌的脂酶活性结果:口腔光滑念珠菌分离株暴露于×6 MIC浓度的氟康唑和×4 MIC浓度的特比萘芬2h后所有菌株的细胞外磷脂酶活性均呈阳性,磷脂酶活性分别下降2.75％和7.39％,暴露于特比萘芬的光滑念珠菌菌株与对照组相比磷脂酶活性差异有统计学意义(t=-2.185,P=0.042),暴露于氟康唑的光滑念珠菌菌株与对照组相比磷脂酶活性差异没有统计学意义(t=-0.439,P=0.666)。　　 全文结论　　 1.HIV感染者口腔白色念珠菌和光滑念珠菌短暂暴露于低于致死浓度高于最小抑菌浓度的氟康唑和特比奈芬后都能够产生一段时间的PAFE,并且有药物浓度越高诱导的PAFE持续时间越长的趋势,说明只要给予足以维持超抑菌浓度的药物剂量,氟康唑和特比奈芬是可以诱导白色念珠菌和光滑念珠菌产生PAFE的。说明去除氟康唑和特比奈芬后的一定时间范围内,白色念珠菌和光滑念珠菌的生长仍处于持续受抑制状态。　　 2.HIV感染者口腔白色念珠菌和光滑念珠菌短暂暴露于低于致死浓度高于最小抑菌浓度的氟康唑和特比奈芬后,对BEC的粘附力降低,与对照组相比差异有统计学意义。说明这种与口腔环境非常相似的情况即短暂地暴露于亚致死浓度的氟康唑和特比奈芬中,可以抑制白色念珠菌和光滑念珠菌的粘附和生长。　　 3.HIV感染者口腔白色念珠菌和光滑念珠菌短暂暴露于低于致死浓度高于最小抑菌浓度的抗真菌药物后都产生不同水平的磷脂酶,暴露于特比萘芬中的胞外磷脂酶活性下降,与对照组相比差异有统计学意义。暴露于氟康唑中的磷脂酶活性与对照组相比差异没有统计学意义。由于实验中我们是在培养48h后检测念珠菌的磷脂酶活性,因此可以认为念珠菌的磷脂酶活性与暴露于抗真菌药的念珠菌的母代无关,而是与这些念珠菌的子代有关。因此实验结果说明,暴露于小剂量抗真菌药的影响可以持续保留到后代,从而影响白色念珠菌和光滑念珠菌的磷脂酶活性。　　 4.以往文献将抗真菌后效应(PAFE)定义为将真菌有限暴露于抗真菌药物中,随后通过稀释、药物失活或反复洗涤的方法将药物去除,真菌的生长受到持续抑制的现象[12]。此定义并未涉及抗真菌药物对念珠菌毒力属性的影响。总结以上实验结果,白色念珠菌和光滑念珠菌临床分离株短暂暴露于小剂量的氟康唑和特比奈芬后均能诱导出一段时间的PAFE,并且在PAFE期间,念珠菌对人类颊黏膜上皮细胞的粘附性和胞外磷脂酶活性两个毒力因素均有不同程度的下降,从而PAFE的临床意义不仅仅限于影响给药方案的制定,同时还可以抑制念珠菌的粘附力和致病性,降低念珠菌毒力。因此,我们认为PAFE的定义可以扩充为,将真菌暴露于浓度高于最小抑菌浓度的抗真菌药中,随后通过稀释、药物失活或反复洗涤的方法将药物去除,真菌的生长受到持续抑制,并且引起真菌毒力发生改变的一系列效应。