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脂解酶是一种能够水解酯类物质的总称,主要包括酯酶和脂肪酶。嗜热脂解酶具有良好的嗜热性和热稳定性、pH稳定性和有机溶剂耐受性等特点,在食品、化妆品、饲料和医药等工业上具有广泛的应用。随着生物技术的迅速发展,现多采用生物信息学方法挖掘具有较好热稳定性的嗜热脂解酶。本文从超嗜热菌Aquiex aeolicus VF5基因组中筛选到2种嗜热脂解酶基因,并实现其在不同表达系统中的外源表达,进而研究重组酶的一系列酶学特性。主要研究结果包括:(1)采用生物信息学的方法从基因数据库中筛选到来源于超嗜热菌A.aeolicus VF5的2种嗜热脂解酶基因Aaeo1和Aaeo2,预测并分析了脂解酶序列和结构特点。结果显示,2种嗜热脂解酶均含有典型的氨基酸保守序列“Gly-Xaa-Ser-Xaa-Gly”和催化三联体“Ser-Asp-His”;Protein blast分析显示Aaeo1和Aaeo2与其他嗜热脂解酶具有一定的相似性。根据细菌脂解酶的分类构建进化树,Aaeo1和Aaeo2分别属于Family VIII和Family V。(2)根据毕赤酵母密码子偏好性等因素综合优化基因Aaeo1和Aaeo2并人工合成,构建GS115/pPIC9K-Aaeo1和GS115/pPIC9K-Aaeo2重组菌株,使用甲醇诱导重组酶表达。结果显示,在发酵上清中检测到酯酶活性;将Aaeo1和Aaeo2氨基酸序列上的3个假定催化位点分别定点突变,检测发现突变菌株基本没有酯酶活性,表明Aaeo1和Aaeo2为脂解酶。(3)研究重组酶Aaeo1和Aaeo2的一系列酶学性质。结果显示,Aaeo1具有广泛的底物谱,Aaeo1和Aaeo2的最适作用底物均为p NPC4(p-nitrophenyl butyrate)。Aaeo1和Aaeo2最适作用温度分别为80°C和85°C,在70°C和80°C均具有良好的热稳定性,放置120 min后,仍保留70%以上的残余酶活性。Aaeo1和Aaeo2的Tm值分别为85.3±0.4°C和86.3±0.3°C。Aaeo1和Aaeo2最适作用pH均为8.0,Aaeo1在pH8.0和pH9.0具有良好的稳定性,放置240 min后仍具有70%以上的相对酶活性,但Aaeo2的pH稳定性较差。金属离子对Aaeo1和Aaeo2的影响与其种类和浓度有关。两者对低浓度的有机溶剂具有良好的耐受性,表面活性剂对酶活性有轻微的抑制作用。蛋白酶抑制剂PMSF和DEPC对重组酶Aaeo1和Aaeo2具有较强的抑制性,而DTT可以提高两者的酶活性。使用最适底物p NPC4测定动力学参数,Aaeo1的Km和kcat分别为5.11±0.31 mM和16.12±2.32 s-1,Aaeo2的Km和kcat分别为0.79±0.03 mM和3.59±1.15 s-1。(4)鉴于Aaeo1和Aaeo2来源于原核生物A.aeolicus VF5,采用融合表达的方法实现重组酶在原核系统中的异源表达。使用融合表达载体pMBP3,构建重组菌株BL21/pMBP3-Aaeo1和BL21/pMBP3-Aaeo2、Origami2/p MBP3-Aaeo1和Origami2/pMBP3-Aaeo2,实现Aaeo1和Aaeo2在BL21和Origami2两种宿主中的异源表达。结果显示,Aaeo1和Aaeo2在大肠杆菌系统中重组蛋白摩尔数和酯酶比活力较小。与真核系统相比,Aaeo1和Aaeo2在大肠杆菌系统中的蛋白表达水平和比活力均低于毕赤酵母系统。