论文部分内容阅读
第一章 Tenascin-C小分子多肽（TCP7）通过抑制Wnt/β-catenin信号通路改善肾脏纤维化研究背景与目的慢性肾脏病（Chronic Kidney Disease,CKD）指由多种原因造成的肾脏损伤或肾功能下降,最终导致慢性肾脏结构异常和功能障碍。慢性肾脏病发病率急剧增加,但是目前临床上缺乏有效的防治药物和干预手段。肌腱蛋白（Tenascin-C,TNC）是一种细胞外基质糖蛋白,在肾脏纤维化的过程中,TNC的表达异常及其形成的促纤维化微环境都对肾脏纤维化起着重要作用。其机制之一是TNC能够募集结合Wnt,从而增强Wnt介导的β-catenin信号通路的激活。本文通过将TNC的FN Ⅲ结构域进行切割,筛选得到其中一个由30个氨基酸组成的多肽（Tenascin-C-derived peptide-7,TCP7）,其能够有效竞争性抑制TNC促肾纤维化的作用,为延缓肾脏纤维化提供了新的治疗策略。研究方法首先合成构建TNC多肽库,将TNC的主要功能结构域FN Ⅲ段按照氨基酸序列,每30个氨基酸进行一次切割,从而得到了包含12个肽段的多肽库。在人肾小管上皮细胞系（Human Kidney proximal tubular Cell,HKC8）中,分别预孵这12个肽段1小时,之后用TNC重组蛋白处理48小时。通过Western blot筛选出能够抑制TNC上调α-平滑肌肌动蛋白（α-smooth muscle actin,α-SMA）最显著稳定的多肽TCP7。后续利用成纤维细胞及小管细胞证实其作用。进一步在体内小鼠单侧缺血再灌注（Unilateral Ischemia Reperfusion,UIRI）模型、单侧输尿管梗阻（Unilateral Ureteral Obstruction,UUO）模型中用 Western blot（WB）、Masson染色、免疫组化、免疫荧光、qPCR等方法证明TCP7缓解肾脏纤维化的作用。另外,用小动物活体成像仪检测TCP7在小鼠各个脏器的分布。用免疫共沉淀（Co-IP）的方法以及放线菌酮（Cycloheximide,CHX）蛋白稳定性实验研究其作用机制。研究结果经过筛选发现5段多肽能够抑制TNC功能,其中TCP7抑制TNC所引起的α-SMA蛋白水平上调效果最明显,其能够抑制成纤维细胞活化增殖及小管上皮细胞间充质转分化上皮-间充质转化（Epithelial-Mesenchymal Transition,EMT）。TCP7与TNC竞争性结合Wnt,从而阻断TNC与Wnt相互作用,使纤维化指标蛋白表达减少。此外,TCP7阻断Wnt与LRP6相互作用,从而抑制经典的Wnt/β-catenin信号通路下游效应分子的活化。小动物活体成像显示TCP7可以特异性靶向输送到受损的肾脏。TCP7治疗的单侧缺血再灌注模型（UIRI）及单侧输尿管梗阻模型（UUO）小鼠肾功能改善,肾间质纤维蛋白沉积及细胞外基质沉积减少,成纤维细胞活化增殖减弱,小管EMT减弱,Wnt/β-catenin信号通路的活化被抑制。研究结论TNC多肽TCP7通过阻断TNC、LRP6与Wnt结合,抑制Wnt/β-catenin信号通路活化,抑制成纤维细胞活化增殖及小管上皮细胞EMT,从而缓解UIRI及UUO小鼠肾脏纤维化发生发展。TCP7能够靶向受损肾脏,长时间留存于肾组织中。这些研究为慢性肾脏病的防治提供了一个新的防治策略。第二章Tenascin-C小分子多肽（TCP7）改善肝、肺纤维化研究背景及目的肝脏纤维化（Hepatic Fibrosis,HF）指由致病因子所致的肝内结缔组织异常增生,导致肝内弥漫性细胞外基质过量沉积的一种病理过程,是肝硬化的前期病变,有显著的临床意义。但目前肝脏纤维化的有效治疗方法还有待探索。TNC在肝脏纤维化过程中的表达异常,且能形成促纤维化微环境,对肝脏纤维化的发生发展有重要影响。我们最近发现TNC小分子多肽TCP7,能够有效抑制Wnt/β-catenin信号通路。我们推测TCP7可能起到延缓肝纤维化的作用,为肝脏纤维化的缓解提供了新的治疗策略。特发性肺间质纤维化（Idiopathic Pulmonary Interstitial Fibrosis,IPF）是一类原因不明的慢性肺间质性疾病,以结构紊乱和弥漫性肺部炎症为特征,造成肺泡间隔增厚,最终导致肺间质纤维化。其死亡率高于大部分肿瘤,但目前的治疗手段主要是减缓肺功能的下降,延长生存期,开发新型有效的治疗手段具有重大临床意义。TNC对肺脏纤维化的发生发展有着重要影响,而TNC小分子多肽TCP7,有可能延缓肺纤维化的发展,减轻肺炎症反应,恢复肺泡壁正常结构,为肺脏纤维化提供了新的治疗策略。研究方法在人肝星状细胞系（LiemingXu-2,LX2）中,预孵TCP7肽段1小时,之后用TNC重组蛋白处理48小时。通过Western blot（WB）,检测TCP7能够抑制TNC诱导的Fibronectin及α-SMA的上调。在小鼠体内注射四氯化碳（CC14）,构建肝纤维化模型,用Western blot、Masson染色、免疫组化、免疫荧光等实验方法证明TCP7缓解肝脏纤维化、肝脏炎症反应及阻断Wnt/β-catenin信号通路的作用。通过对小鼠气管注射博来霉素（Bleomycin,BLM）,构建小鼠肺脏纤维化模型,用Western blot、HE染色、Masson染色、免疫组化等实验方法证明TCP7能够减缓肺脏炎症反应,改善肺泡结构,缓解特发性肺脏纤维化。研究结果在LX2细胞中,TCP7能够稳定抑制TNC所引起的Fibronectin、α-SMA蛋白水平上调。在CCl4肝纤维化模型中,TCP7治疗后小鼠肝功能指标有所改善,且肝血窦周纤维蛋白沉积及肝细胞外基质沉积减少,星状细胞向肌成纤维细胞的转化也明显减少,炎症反应也有所减轻,Wnt/β-catenin信号通路的活化得到一定的抑制。在BLM诱导的肺纤维化模型中,TCP7治疗组小鼠肺脏纤维蛋白沉积明显减少,肺泡壁厚度、肺泡结构得到恢复,肺组织炎症显著减轻。研究结论新型TNC小分子多肽TCP7,能够抑制TNC诱导的肝星状细胞向肌成纤维细胞转变,缓解CC14造成的肝损伤以及BLM造成的肺脏纤维化和肺间质炎症。此课题为肝脏纤维化、肺脏纤维化及肺间质炎的防治提供了一个新的治疗策略。