目的：1.研究体素内不相干运动扩散加权成像(intravoxel incoherent motion diffusion-weighted imaging, IVIM-DWI)参数用于肝脏缺血再灌注损伤时测量的可重复性,同一测量者多次测量或不同测量者间测量的一致性。2.探讨兔肝脏缺血再灌注损伤中体素内不相干运动扩散加权成像参数与细胞损伤的生化指标及组织病理学变的相关性。材料与方法：1.动物模型分组及制备32只健康新西兰大白兔(均为雌性,体重为2-3kg,由广东省动物实验中心提供)根据肝脏缺血一小时后再灌注时长被平均分为A组(假手术组)、B组(再灌注1h)、C组(再灌注4h)及D组(再灌注12h)四个组别,每组样本数目均为8只。B、C、D组动物使用无损金属血管夹夹闭肝左叶及右前叶管道结构(门静脉主干、肝动脉及胆管)60min,使肝脏70%左右区域出现缺血。60min后撤除血管夹,观察肝脏血流恢复情况(再灌注),缝合皮肤,各组在达到预期的再灌注时长后进行下一步检查。A组作为假手术组,暴露肝十二指肠韧带后不阻断肝脏血流,复位腹部脏器后缝合皮肤,并进行下一步检查。2.影像检查方法及图像分析2.1.MRI扫描方案所有达到预期缺血再灌注时长的动物均使用Achieva 1.5T扫描仪(Philips Healthcare, Best, Netherlands)进行IVIM-DWI磁共振成像检查。麻醉后将动物以头先进-仰卧位摆放在兔子专用的八通道相控阵线圈(Product model:CG-RBC18-H150-AP, Shanghai Chenguang Medical Technologies Co., Ltd., Shanghai, China)中。采用轴位扫描,范围包括整个肝脏。IVIM-DWI图像采集使用单次激发平面回波成像脉冲序列(single-shot echo-planar imaging pulse sequence),在自由呼吸状态下(free-breathing method)下以并行采集模式(parallel imaging)进行扫描。使用反转恢复频率选择预饱和技术(SPIR)对脂肪信号进行抑制。本研究拟采用12个不同的b值(从0,10,20,30,40,50,75,100,150,300,500,到800 sec/mm2),其中9个b值低于：200 sec/mm2,在保证灌注相关参数准确性的同时扫描用时不会过长。所有扩散加权梯度通过x轴,y轴及z轴三个正交方向施力B. IVIM-DWI其余相关参数如下：TR/TE,1310/69.8 ms;FOV, AP/PL/FH:150mm/150mm/45mm;层厚/层间距：3mm/0mm; NSA:6; ETL: 53。2.2.图像后处理与分析扫描结束后,]VIM-DWI的原始数据发送至厂家提供的后处理平台(Extended Workspace, Philips Healthcare)并使用PRIDE DWI Tool软件(version 1.5, Philips Healthcare)获得ADC及IVIM参数图。基于开放获取的IDL程序——MPFIT内置的Levenberg-Marquardt算法,可对12个b值下采集的数据进行非线性最小二乘法曲线拟合(nonlinear least-squares curve fitting),以计算出D,D*及f等相应参数值,使用的公式如下：SI/SIo= (1-f)·exp(-bD)+f·exp(-bD*),其中SI代表某个非0 sec/mm2的b值下所采集图像的信号强度(signalintensity),而SI0代表b=0 sec/mm2时测得的信号强度。而计算ADC值时,使用12个b值下所采集的图像信号强度数据进行单指数拟合(monoexponential fitting),公式如下：SI/SIo= exp(-bADC)。所有参数图均在逐像素(pixel-by-pixel)基础上生成。两位放射科医生(测量者A,三年影像实践经验；测量者B,十年影像学实践经验)在不知每个动物分组的情况下单独对ADC及IVIM参数图手动勾画(operator-defined)感兴趣区(region of interest, ROI)进行测量。为最大程度地保持ROI与病理标本取材区域的一致性,仅选取肝左内叶中部层面进行ROI测量,并注意避开信号不均匀区域、伪影严重区域及大的肝脏血管。每个测量对象放置三个ROI(大小尽可能一致)并以三者测量值均值作为该区域的最终测量数值。为了评价同一测量者两次不同测量过程中数值的一致性(intraobserver agreement),测量者A在第一次测量两周后对所有参数图进行第二次重复测量。为了评价不同测量者在测量过程中数值的一致性(interobserver agreement),测量者A前后两次测量的均值将用于与测量者B测量一次的数值进行比较。3.生化指标测定MRI扫描之后,经耳缘静脉抽取静脉血样并送至广东省人民医院检验科检测,检验指标包括血清谷草转氨酶AST,血清谷丙转氨酶ALT, AST/ALT及γ-GGT。4.病理标本制备及评分方案抽取血样后经耳缘静脉留置针注射过量戊巴比妥钠处死动物,取出肝左内叶中部组织块并制取病理标本,以苏木精-伊红染色法进行染色。组织学分析包括定性分析(即显微镜下直接观察肝组织细胞肿胀及肝窦狭窄情况)及半定量分析(病理评分)。半定量评分方案中,根据一张玻片上的五个随机视野(200×),肝窦(hepatic sinusoid)狭窄程度可分为五个级别：1级=肝窦无狭窄或闭塞；2级=轻度(≤50%肝窦狭窄)；3级=中度(>50%肝窦狭窄或≤50%的少数肝窦闭塞)；4级=(>50%肝窦闭塞)；5级=所见肝窦全部闭塞。肝窦炎症细胞浸润程度可分为四个级别：1级=未见明确炎细胞浸润；2级=轻度浸润(局灶性浸润)；3级=中度浸润(小范围片状浸润)；4级=重度浸润(大范围弥漫性浸润)。肝窦淤血可分为四个级别：1级=未见明确淤血；2级=轻度淤血(局灶性)；3级=中度淤血(小范围红细胞瘀滞)；4级=重度淤血(大范围弥漫性淤血)。三套半定量评分结果之和被视为该动物病理评分结果。两个病理科医生(评分者C,2年病理学实践经验；评分者D,8年病理学实践经验)在未知动物分组的情况下独立对玻片进行评分,两者评分平均值作为该动物最终病理评分结果。5.统计学方法统计学分析使用的软件包括SPSS 19.0版本(SPSS, Chicago,Ill)及MedCalc software (MedCalc, Mariakerke, Belgium)。为确定IVIM参数及ADC值在同一扫描序列中测量的可重复性,动物造模前选取一只健康新西兰白兔(雌性,体重2.8kg)重复扫描IVIM-DWI序列八次,并由测量者A分别对8次扫描图像进行参数测量。使用变异系数(coefficients of variation, CV)作为评估指标。使用组内相关系数(intraclass correlation coefficient, ICC)及Bland-Altman分析(Bland-Altman plots with 95% limits of agreement)确定测量者内(intraobserver)及测量者间(interobserver) IVIM参数及ADC值测量的一致性。使用变异系数CV评价各组内不同动物所测参数的一致程度。使用Kappa系数评价两位病理科医生病理评分的一致性。使用Shapiro-Wilk test检验不同组别间数据的正态性,使用Levine’s test检验不同组别间数据的方差齐性。不同组别间参数测量结果符合正态分布及方差齐性时,使用单向方差分析(one-way analysis of variance, ANOVA)比较组间差异,并以Bonferroni post hoc test进行两两比较；不同组别间参数测量结果不符合或未完全正态分布及方差齐性,或比较对象为等级变量时,使用Kruskal-Wallis test比较组间差异,并以Dunn-Bonferroni post hoc test进行两两比较使用Spearman rank correlation analysis分析f值,D值,ADC值与病理评分间的相关性；使用Pearson correlation analysis分析分析f值,D值,ADC值与生化指标间的相关性。分析相关性时,包含或不包含假手术组的情况均考虑在内。P值≤0.05表示数据有统计学意义。结果：1.影像学参数测量结果1.1.影像学参数测量的可重复性及一致性1.1.1 IVIM参数及ADC值在同一扫描序列中测量的可重复性D值在使用同一扫描序列扫描时CV值为3.44%,可重复性好。f值在使用同一扫描序列扫描时CV值为9.86%,可重复性好。D*在值在使用同一扫描序列扫描时CV值为44.30%,可重复性差。ADC值在使用同一扫描序列扫描时CV值为3.62%,可重复性好。1.1.2影像学参数的测量者内(intraobserver)及测量者间(interobserver)一致性各影像学参数的测量者内一致性(组内相关系数)如下：D值,0.973(0.945-0.987),一致性好；f值,0.951(0.899-0.976),一致性好；D*值,0.597(0.174-0.803),一致性一般；ADC值,0.974(0.947-0.987),一致性好。各影像学参数的测量者间一致性(组内相关系数)如下：D值,0.977(0.953-0.989),一致性好；f值,0.987(0.974-0.994),一致性好；D*值,0.548(0.073-0.779),一致性一般；ADC值,0.967(0.933-0.984),一致性好。1.2.组间参数的比较Shapiro-Wilk test示所测D值,f值,D*值及ADC值在A组、B组、C组及D组均符合正态分布。Levine’s test示所测D值,f值,D,*值及ADC值在A组、B组、C组及D组均满足方差齐性。因此,使用单向方差分析对各组参数测量值进行总体比较及Bonferroni posthoc test进行两两比较。各组ADC值测量如下(均数±标准差,单位×10-3mm2/sec):A组1.29±0.09,B组1.04±0.10,C组0.87±0.07,D组0.94±0.11。方差分析示统计量F为31.48,P<0.001,以Bonferroni post hoc test进行两两比较示A组(即假手术组)与B组、C组及D组均存在统计学差异,P值均小于0.001；B组与C组间P值为0.006,有统计学差异；B组与D组间P值为0.314,C组与D组间P值为0.676,无统计学差异。各组D值测量如下(均数±标准差,单位×10-3mm2/sec):A组1.1±0.07,B组0.93±0.08,C组0.82±0.05,D组0.88±0.10。方差分析示统计量F为26.97,P<0.001,以Bonferroni post hoc test进行两两比较示A组与B组、C组及D组均存在统计学差异,P值均小于0.01；B组与C组间P值为0.054, B组与D组间P值为1.000,C组与D组间P值为0.794,均无统计学差异。各组D*值测量如下(均数±标准差,单位×10-3mm2/sec):A组143.3±39.3,B组141.6±35.5,C组124.5±47.4,D组142.7±22.9方差分析示统计量F为0.47,P值=0.706,组间无统计学差异。各组f值测量如下(均数±标准差,单位%)：A组14.6±3.67,B组12±2.8,C组5.0±2.2,D组7.5±3.1。方差分析示统计量F为16.99,P<0.001,以Bonferroni post hoc test进行两两比较示A组与B组间P值为0.708,无统计学差异；A组与C组及D组间存在统计学差异,P值均小于0.01；B组与C组间P值小于0.001,B组与D组间P值为0.023,均存在统计学差异；C组与D组间P值为0.664,无统计学差异。2.生化指标测量结果Shapiro-Wilk test示所测AST值,ALT值,AST/ALT值在四个组别中不完全符合正态分布,因此使用非参数检验进行比较。Shapiro-Wilk test示γ-GGT指标在四个组别中均符合正态分布。Levine’s test示各组间方差不齐,同样选用非参数检验进行比较。各组AST值中位数及四分位间距(位于括号内)如下(单位均为IU/L)：A组54.5(55.0),B组237(393.8),C组557.5(615.5),D组1758.5(2417.8)。Kruskal-Wallis test示P值=0.002,以Dunn-Bonferroni post hoc test进行两两比较示A组(即假手术组)与B组、C组及D组均存在统计学差异,P值分别为0.016,0.016,小于0.01；B组与C组间P值为1.000,B组与D组间P值为0.273,C组与D组间P值为0.273,无统计学差异。各组ALT值中位数及四分位间距(位于括号内)如下(单位均为IU/L)：A组62.0(97.8),B组725.5(2265.5),C组2926.5(3261.0),D组11002.5(12647.8)。Kruskal-Wallis test示P值=0.002,以Dunn-Bonferroni post hoc test进行两两比较示A组与B组、C组及D组均存在统计学差异,P值分别为0.016,小于0.01,小于0.01；B组与C组间P值为1.000,B组与D组间P值为0.273,C组与D组间P值为0.273,无统计学差异。各组AST/ALT值中位数及四分位间距(位于括号内)如下：A组0.9(0.5),B组0.3(0.2),C组0.2(0.1),D组0.3(0.4)。Kruskal-Wallis test示P值=0.005,以Dunn-Bonferroni post hoc test进行两两比较示A组与B组、C组及D组均存在统计学差异,P值均为0.016；B组与C组间、B组与D组间、C组与D组间P值均为1,无统计学差异。各组γ-GGT值中位数及四分位间距(位于括号内)如下(单位均为IU/L)：A组10.5(6.5),B组20.5(26.8),C组28.5(57.8),D组58.5(84.0)。Kruskal-Wallis test示P值=0.012,以Dunn-Bonferroni post hoc test进行两两比较结果中,仅A组(即假手术组)与C组存在统计学差异,P值为0.016；A组与D组间P值为0.070,A组与B组间、B组与C组间、B组与D组间、C组与D组间P值均为1,无统计学差异。3.病理评分结果两位病理科医生病理评分的Kappa值为0.706(P<0.001),表明一致性较好。以两者评分均值作为最终测量结果,得到各组中位数及四分位间距(位于括号内)如下：A组5(1),B组6.75(1.25),C组8.25(2.38),D组8.5(3.25)。非参数检验Kruskal-Wallis test示P值=0.002,以Dunn-Bonferroni post hoc test进行两两比较示A组(即假手术组)与B组、C组及D组均存在统计学差异,P值均小于0.001；B组与C组间有统计学差异,P值为0.012,B组与D组间P值为0.783,无统计学差异；C组与D组间P值为1,无统计学差异。4.影像学参数与生化指标相关性IVIM参数(f值,D值)及ADC值与各生化指标测量值(AST, ALT, AST/ALT及γ-GGT)的相关性分析所有有统计学意义的结果中,只有使用包含假手术组在内四个组别进行分析时的f值,D值,ADC值与AST/ALT的相关系数达到0.5以上(即中度以上的相关性),其中f值与AST/ALT的相关系数r为0.538,P=0.002；D值与AST/ALT的相关系数r为0.747,P<0.001；ADC值与AST/ALT的相关系数r为0.748,P<0.001。5.影像学参数与病理评分相关性使用包含对照组在内四个组别进行分析时,f值、D值、ADC值与组织病理评分有着非常好的相关性,相关系数rs分别为-0.753(P<0.001),-0.824(P<0.001),-0.861(P<0.001)。排除对照组而只使用三个处理组进行分析时,f值、D值、ADC值与组织病理评分有着中等到良好的相关性,相关系数rs分别为-0.680(P<0.001),-0.598(P<0.001),-0.707(P<0.001)。结论：本研究发现体素内不相干运动扩散加权成像参数中D值,f值及ADC值有着良好的测量可重复性,测量者内及测量者间一致性,能较可靠地用作兔肝脏缺血再灌注损伤的影像学评估指标。灌注分数f值与反映肝窦狭窄、白细胞浸润及淤血程度的病理评分指标有着很好的相关性,可在兔肝脏缺血再灌注损伤中无创性评估与微循环障碍相关病理改变的严重程度,但在早期检出缺血再灌注损伤改变的敏感性欠佳。D值在缺血再灌注损伤早期即具备一定敏感性,但再灌注期间与肝脏损伤相关的血清生化指标无显著相关性。肝脏缺血再灌注损伤中,微循环相关的改变可能是表观扩散系数ADC值改变的主要原因,ADC值同时兼备灌注分数f值及真扩散系数D值的优点,既能定量评价肝脏缺血再灌注损伤的微循环障碍的程度,同时也具备早期检出损伤的敏感性。