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目的缺氧是很多肿瘤组织共有的表现,其具有诱导肿瘤细胞代谢改变,促进血管新生,增强浸润转移及产生耐药等特性。在血液系统恶性疾病中,同样可以发现瘤细胞处于一个缺氧微环境。缺氧可以激活重要的转录因子缺氧诱导因子-1 α(hypoxia-inducible factor-1α,HIF-1α)表达,是导致多发性骨髓瘤(mutiple myeloma,MM)血管新生能力增强的重要因素,而血管新生与MM疾病进展和预后密切相关。藤黄酸是藤黄中提取的有效成分,在众多实体瘤体内外实验中均显示出良好的抗肿瘤效果。本研究主要探讨藤黄酸是否可以抑制缺氧时MM的HIF-1 α及其下游血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor,VEGF)表达,并探讨相关具体分子机制。方法通过对藤黄酸、汉黄芩和姜黄素三种中药有效成分进行CCK-8细胞增殖实验,选取对MM细胞无明显细胞毒性浓度,在缺氧条件下干预MM细胞,通过酶联免疫吸附试验(ELISA)检测细胞培养上清VEGF表达含量变化,实时荧光定量PCR检测不同缺氧时间对MM细胞VEGF基因表达变化、药物对缺氧培养MM细胞HIF-1 α及VEGF基因表达影响,选取有效的药物成分进行下一步实验。免疫荧光染色观察缺氧时细胞内HIF-1 α蛋白改变及药物对其影响,Western Blot验证缺氧时细胞内HIF-1 α和VEGF蛋白改变及药物对其影响,进一步Western Blot检测缺氧时PI3K/Akt/mTOR通路变化情况,以及通路相关抑制剂对HIF-1α和VEGF表达和PI3K/Akt/mTOR通路的影响。建立荷瘤裸鼠模型,观察MM细胞的成瘤性,同时设对照组,隔天尾静脉注射藤黄酸2mg/kg组和4mg/kg组,连续治疗2周,记录瘤体最大径与最小径,2周后处死裸鼠,摘取瘤组织,计算瘤体积和重量变化,免疫组织化学染色CD31阳性微血管、HIF-1 α和VEGF,观察药物在体内的抗MM效果。结果MM细胞U266和RPMI-8226分别缺氧培养2、4、8和16小时,在缺氧培养2小时时,RPMI-8226和U266细胞VEGF mRNA水平分别是常氧培养的1.50±0.10和4.77±0.55倍,4小时时其增高最为明显,分别为2.88±0.25倍和9.19±0.64倍,后随着缺氧时间延长,VEGF mRNA表达逐渐下降,8小时时为2.74±0.23和4.32±0.38倍,16小时时为1.36±0.12和2.57±0.25倍,与常氧组比较,差别均有统计学意义。分别使用三种中药藤黄酸、汉黄芩和姜黄素干预MM细胞24小时,对细胞无明显毒性的浓度上限分别为0.2 μ M、20 μM和4 μ M。选取对细胞无明显毒性浓度药物,0、0.05、0.1和0.2 μM藤黄酸干预U266细胞4小时后VEGF mRNA表达量分别是常氧对照组的9.19±0.64倍,7.33±0.51倍,5.90±0.40 倍和 4.76±0.44 倍;RPMI-8226 细胞 VEGF mRNA 表达量分别是常氧对照组 2.88±0.25 倍,2.67±0.15 倍,2.34±0.18 倍和 1.99±0.21 倍。常氧组藤黄酸各浓度对细胞VEGF mRNA表达量无显著影响。0、10、20 μM汉黄芩和0、2、4 μ M姜黄素不论在常氧组还是缺氧组,对两种MM细胞VEGF mRNA表达量均无显著影响。常氧对照组细胞培养8小时后,U266细胞VEGF分泌量为15.47±1.25 pg/(ml*105cells),RPMI-8226 细胞则为 22.47±2.05 pg/(ml*105cells)。0.05、0.1和0.2 μM藤黄酸干预藤黄酸8小时后,细胞VEGF分泌量并无明显变化,仅在U266 细胞株中,0.2 μ M 藤黄酸组 VEGF 分泌量降为 11.37±0.81 pg/(ml*105cells)。缺氧培养8小时后两株细胞VEGF分泌均显著增多,分别为31.30± 1.57 pg/(ml*105cells)和 45.10±3.25 pg/(ml*105cells),0.1 μ M 和 0.2 u M 藤黄酸均可抑制缺氧组 U266 细胞 VEGF 分泌,分别为 26.28± 1.46 pg/(ml*105cells)和 20.74±1.39pg/(ml*105cells),随着药物浓度增加,抑制效果增强。与单纯缺氧组比较,RPMI-8226细胞株则在0.2 μ M藤黄酸时对VEGF分泌有显著抑制效果,达到33.07±3.41 pg/(ml*105cells)。在常氧和缺氧条件下,分别培养U266细胞4小时,可见缺氧条件下U266细胞VEGF蛋白表达显著增多,0.05,0.1和0.2μM藤黄酸处理细胞后,细胞缺氧诱导的VEGF蛋白表达量随着藤黄酸浓度增加而减少,0.2 μM藤黄酸时VEGF蛋白下降最为明显。相同实验条件,细胞HIF-1 α mRNA表达量并无明显差别,但HIF-1 α蛋白可见常氧组无明显表达,而缺氧组HIF-1 α蛋白表达显著增多,0.05,0.1和0.2μM藤黄酸干预缺氧组细胞后,HIF-1α蛋白表达随着藤黄酸浓度增加而减少,0.2μM时HIF-Iα蛋白下降最为明显。免疫荧光染色同样发现0.2 μM藤黄酸处理缺氧下U266细胞4小时,HIF-1 α荧光强度最弱。与常氧组比较,缺氧4小时后U266细胞PI3K/Akt/mTOR信号通路Akt与mTOR磷酸化增多,且HIF-lα,VEGF蛋白表达上调。0.2μM藤黄酸治疗组在缺氧下可以明显抑制Akt与mTOR蛋白的磷酸化,同时显著下调HIF-1 α和VEGF蛋白表达。PI3K抑制剂LY294002或mTOR抑制剂雷帕霉素(rapamycin)干预缺氧U266细胞株4小时,PI3K抑制剂LY294002组Akt和mTOR蛋白磷酸化显著下降,且HIF-1 α,VEGF蛋白表达明显受抑。缺氧时mTOR抑制剂雷帕霉素组对Akt磷酸化并无影响,但可显著抑制mTOR磷酸化,且同样下调HIF-1α,VEGF蛋白表达。裸鼠体内实验,对照组瘤体积增长显著快于用药组,且2mg/kg治疗组瘤体积增长快于4mg/kg治疗组。用药2周后,瘤体积分别为615.50±69.79mm3,323.33±53.54 mm3和 163.34±30.11mm3,瘤重分别为0.59±0.10g,0.43±0.07g和0.22±0.06g,而裸鼠治疗前后体重并无明显变化。免疫组织化学染色可见与对照组相比,治疗组CD31阳性微血管密度明显降低,且4mg/kg组低于2mg/kg组,差别具有统计学意义。治疗组VEGF和HIF-1 α表达水平较对照组显著下降,且4mg/kg组低于2mg/kg组,差别具有统计学意义。结论缺氧时U266和RPMI-8226细胞株VEGF mRNA表达上调,VEGF分泌增多。藤黄酸可以抑制缺氧时U266和RPMI-8226细胞株VEGF mRNA表达与蛋白分泌。缺氧时U266细胞HIF-1 α蛋白表达增高,藤黄酸可以抑制缺氧时U266细胞HIF-1 α蛋白表达和VEGF mRNA与蛋白表达,而对HIF-1 α mRNA无影响,藤黄酸是通过转录后调控HIF-1 α蛋白的表达。缺氧时U266细胞PI3K/Akt/mTOR信号通路进一步活化,该信号通路抑制剂可以抑制细胞HIF-1 α/VEGF表达。藤黄酸通过对U266细胞缺氧时PI3K/Akt/mTOR信号通路激活的抑制作用,下调HIF-1 α/VEGF表达,从而减弱细胞对缺氧环境的适应能力。藤黄酸可以抑制U266裸鼠体内移植瘤的微血管生长,抑制HIF-1 α/VEGF表达,从而抑制移植瘤生长,达到治疗MM的目的。