慢性鼻-鼻窦炎(chronic rhinosinusitis，CRS)发病机制复杂，研究提示多种细胞因子及炎性介质有助于黏膜炎症的持续及加重。而阻断个别因子或介质难以达到治疗目的。我们设想：通过阻断炎症信号网络的上游关键调控点，进而抑制细胞因子和炎症介质的产生，以达到切断恶性循环，减轻炎症反应的目的。另糖皮质激素(glucocorticoid，GC)是目前公认的最有效的抗炎药物，已用于治疗CRS。但部分患者出现激素抵抗。而p38丝裂原活化蛋白激酶(mitogen-activited protein kinase，MAPK)及核因子-kappaB(nuclear factor-kappaB，NF-κB)是炎症信号转导网络中最重要的蛋白激酶及转录因子，且参与多种细胞因子、炎性介质的调控，并可能与激素不敏感相关。另外鼻黏膜上皮细胞因参与局部组织炎症反应及免疫调控作用而被关注，我们以脂多糖(lipopolysaccharide，LPS)致炎体外鼻黏膜上皮细胞为载体，试图揭示P38MAPK/NF-κB信号转导通路对炎症鼻黏膜上皮细胞细胞因子、炎性介质以及糖皮质激素受体的调控作用，为以P38MAPK/NF-κB为靶点的治疗提供理论依据。　　 另外，本课题同时对人鼻黏膜上皮细胞原代培养的酶消化分离细胞方法进行探索性改进，获得足够数量的原代细胞以实施上述实验。本研究分3章：　　 第1章酶消化分离法原代培养人鼻黏膜上皮细胞的改进　　 目的：探索对酶消化分离法原代培养人鼻黏膜上皮细胞的实验步骤和技术要点进行改进，以提高原代培养成功率并获得更多数量的原代细胞，为后续实验提供良好的培养模型。方法：在酶消化分离细胞、无血清培养法的基础上，对取材处理、消化酶应用等步骤进行了改进，如翻揭分离获取黏膜层、消化中加入Ⅰ型DNA酶(DNase typeⅠ)、胶原酶消化后含黏膜块的溶液中直接加入胰蛋白酶，以及应用不包被的培养皿培养等。原代培养的鼻黏膜上皮细胞经免疫荧光组织化学染色细胞角蛋白(cytokeratin,CK)8/18进行鉴定。结果：鼻黏膜原代培养细胞生长良好，6～8d汇合可用于传代或后续实验。CK8/18免疫荧光染色阳性鉴定为上皮源性细胞。结论：酶消化分离细胞、无血清培养法可成功建立人鼻黏膜上皮细胞原代培养模型，对取材处理、酶消化等步骤进行上述改进，可以获得更多数量以及纯度较高的鼻黏膜上皮细胞。　　 第2章NF-κB信号转导通路对炎症鼻黏膜上皮细胞细胞因子的调控及意义　　 目的：探讨脂多糖(lipopolysaccharide，LPS)诱导体外培养的鼻黏膜上皮细胞致炎后核因子-κB(nuclear factor-kappa B，NF-κB)的活性变化对局部细胞因子的调控作用，以及探索p38MAPK(mitogen-activited protein kinase，MAPK)对NF-κB激活的调节作用。方法：采用无血清原代培养法行正常鼻黏膜上皮细胞分离和培养，传代3到4代后，经LPS诱导以及加入NF-κB阻断剂wedelolactone前后，应用凝胶电泳迁移率分析法(electrophoretic mobility shiftassay，EMSA)检测NF-κB的DNA结合活性，采用反转录-聚合酶链反应(RT-PCR)法检测细胞因子(IL-1β，TNF-α，IL-5，IL-6，IL-8，GM-CSF，RANTES，eotaxin,eotaxin-2)，黏附分子(VCAM-1，ICAM-1)和炎性介质(iNOS，COX-2)mRNA的表达水平。进一步采用EMSA法检测p38MAPK特异阻断剂SB203580对NF-κB DNA结合活性的影响。结果：LPS(1mg/L)诱导鼻黏膜上皮细胞使NF-κB DNA结合活性明显增强(p=0.004)，并使IL-1β，IL-8和COX-2 mRNA的表达水平增高(p=0.000)；其它因子未诱导出表达；应用NF-κB阻断剂wedelolactone后NF-κB结合活性以及IL-1β，IL-8和COX-2 mRNA的表达水平下调，与LPS诱导组比较有统计学差异(p值分别为0.002，0.000，0.000，0.000)；应用p38MAPK阻断剂SB203580可部分下调LPS诱导的NF-κB DNA结合活性的增加，有统计学差异(p=0.036)。结论：NF-κB通路参与了对LPS体外诱导鼻黏膜上皮细胞IL-1β，IL-8和COX-2转录水平的调控；p38MAPK参与了对LPS致炎鼻黏膜上皮细胞NF-κB结合活性的调节。　　 第3章 p38MAPK/NF-κB信号转导通路对炎症鼻黏膜上皮细胞糖皮质激素受体转录水平的调控　　 目的：探讨p38丝裂原活化蛋白激酶(mitogen-activited protein kinase，MAPK)和核因子κB(nuclear factor-kappa B，NF-κB)信号转导通路对炎症鼻黏膜上皮细胞中糖皮质激素受体(glucocorticoid receptor，GR)转录水平的调控作用，以及p38MAPK在上述机制中对NF-κB的调控作用。方法：采用蛋白印迹法(Western blot)检测脂多糖(lipopolysaccharide，LPS)以不同浓度和于不同时间加入培养的鼻黏膜上皮细胞后活化的p38MAPK(磷酸化p38MAPK)表达的变化，及加入p38MAPK特异性阻断剂SB203580对其活性的抑制作用；应用逆转录-多聚酶链反应(reverse transcription-polymerase chain reaction,RT-PCR)法检测LPS致炎鼻黏膜上皮细胞后GR亚型GRα和GRβ转录水平的变化，以及加入SB203580和NF-κB阻断剂Wedelolactone后对受体mRNA表达的抑制作用；应用凝胶电泳迁移率分析(electrophoretic mobility shift assay，EMSA)法检测SB203580对NF-κB DNA结合活性的抑制作用。结果：随着LPS浓度的增加(0.01mg/L，0.1mg/L)，鼻黏膜上皮细胞中磷酸化p38MAPK的表达升高，但无统计学差异(p=0.424，0.99)；当LPS的刺激浓度为1mg/L时表达最高(p=0.001)；浓度为10Mg/L时不再继续升高(p=.002)。LPS刺激鼻黏膜上皮细胞15min时磷酸化p38MAPK的表达即升高(p=0.006)；30min时表达最高(p=0.009)；45min后渐降(p=.021)，60min时表达量已经很低，与未加LPS组比较差异无统计学意义(p=1.000)。在加入LPS之前30min加入p38特异性阻断剂SB203580可抑制p38MAPK活性(p=.001)。未加LPS时，GRαmRNA即有较高表达，而GRβ mRNA表达微量；LPS诱导鼻黏膜上皮细胞GRβ mRNA表达显著升高(p=0.011)，且能被SB203580抑制以及被Wedelolactone不完全抑制，与对照组比较差异有统计学意义(p=0.01)。而GRα在LPS刺激后虽有增加，但差异无统计学意义(p=0.05)，且未能被阻断剂抑制。LPS刺激鼻黏膜上皮细胞后NF-κB的DNA结合活性升高，可被SB203580部分抑制(p=0.036)。结论：p38MAPK信号转导通路在LPS致炎的鼻黏膜上皮细胞中被激活，且其对GRβ转录水平的调控可能部分是通过NF-κB实现的。