肝脏纤维化(hepatic fibrosis，HF)是指因过多的细胞外基质成分和成纤维细胞聚集而导致正常肝脏组织结构改变和功能丧失的一类疾病。该病理生理变化主要为细胞外基质（extracellular matrixc.ECM）异常堆积和ECM成分发生重新分布，进而引起纤维结缔组织的增生，正常肝小叶结构破坏，假小叶形成，最终可发展为肝硬化、肝癌[1-2]。在 HF发生发展过程中，肝星状细胞（Hepatic stellate cells.HSC）的激活和增殖是纤维化过程中最关键的因素[3-4]。因此积极研究肝星状细胞激活和凋亡过程及相关因素，找到HSC活化和凋亡的靶点，逆转纤维化进展中的中心环节，寻找有效的治疗HF药物，对HF相关疾病的防治理论与临床治疗都具有重大意义。　　Rho（Ras homologue，三磷酸鸟苷酶）蛋白属小G超蛋白家族的亚家庭成员，根据其序列的同源程度和功能不同，可将其分为RhoA，Rac1，Cdc42和缺乏GTP酶活性四大类[5-7]。RhoA（Ras同源基因家族，成员A）是一种鸟苷酸结合蛋白，也是目前已知的一种能调节肌动蛋白细胞骨架、细胞形态异质性及细胞运动性的重要细胞因子，同时还是Rho/Rho激酶信号传导通路中的主要信号分子。目前研究发现激活后的RhoA还能影响更多生物学行为，包括细胞骨架的组装、转录因子的激活、细胞周期的调节等，而这些都与纤维化发展过程密切相关。因此作者猜测，研究HF过程中RhoA的表达及其影响因素，将会为抗纤维化治疗提供新的思路。　　吡非尼酮（pirfenidone，PFD），是20世纪70年代末合成的小分子化合物，最初的研究发现PFD具有一定的抗炎作用，随着研究的进展，越来越多的结果证实其对肺、肾、心脏、皮肤等组织器官纤维化也具有一定的治疗作用。作为一种广谱抗纤维化药物，吡非尼酮对肺纤维化的治疗效果尤为显著，而近年来的一些研究证实其对肝脏纤维化也有较好的治疗作用[8]。　　HSC-T6由SV40-T6抗原转染原代大鼠肝星状细胞而来，其表达Desmin（肌细胞纤维蛋白）和α-SMA（成纤维细胞中平滑肌肌动蛋白α），具有活化 HSC的特征，因此常用于实验研究肝纤维化发生、转归过程及影响机制[9]。　　本论文研究以体外培养的大鼠肝星状细胞株（HSC-T6）为实验模型，通过观察吡非尼酮对其作用后，肝星状细胞形态学及增殖的变化、RhoA的表达和活性改变，旨在研究RhoA在肝纤维化形成过程中的表达及作用机制，进而探讨肝纤维化相关疾病的预防及治疗[10-11]。　　1、研究目的：　　本实验主要研究吡非尼酮作用于活化的大鼠肝星状细胞株后，广谱抗纤维化药物吡非尼酮对HSC-T6形态及数目、细胞增殖、RhoA表达及活性的影响，从而进一步探讨PFD抗肝纤维化的作用机制。　　2、研究方法：　　2.1细胞培养；　　2.2台盼蓝拒染实验鉴定细胞活率；　　2.3吡非尼酮作用于HSC-T6后，倒置显微镜下定时观察细胞形态的变化；　　2.4 CCK-8法检测细胞增殖的变化；　　2.5免疫印迹法（Western Blot）检测吡非尼酮对RhoA蛋白表达的影响；　　2.6用Quantity-one凝胶成像分析系统分析各条带的总灰度值，并与其相对应的内参(GAPDH)的总灰度值相比较，得出灰度比值进行定量统计分析。统计分析采用SPSS17.0软件进行分析；　　3、研究结果：　　3.1细胞形态　　定时用倒置显微镜下观察培养的HSC-T6细胞株，未经吡非尼酮处理的肝星状细胞形态多不规则，多数呈多角形、圆形或带伪足的星形。吡非尼酮（100ug/ml,500ug/ml）处理后，细胞形状稍变小，伪足缩短，细胞数目稍减少。　　3.2台盼蓝计数心肌细胞存活率　　通过台盼蓝计数 HSC-T6细胞，结果显示 HSC-T6细胞的存活率大于95％(67/1420,67为蓝染细胞即死细胞)。　　3.3 CCK-8法检测细胞增殖的变化　　与对照组相比，吡非尼酮浓度为100ug/ml和500ug/ml时，抑制细胞增殖作用显著（p<0.01）。从变化趋势可以看出，吡非尼酮对HSC-T6细胞的增值具有抑制作用且有浓度依赖性。　　3.4 Western Blot检测结果　　吡非尼酮（0,100ug/ml,500ug/ml）作用于HSC-T6细胞24h后。当 PFD为100ug/ml时，与对照组相比，RhoA蛋白的表达下调不明显，无统计学意义。当PFD为500ug/ml时，与对照组相比，RhoA蛋白的表达明显下调，具有差异性（p<0.05）。　　四、研究结论：　　吡非尼酮作用HSC-T624h小时后，细胞形态及数目发生改变，对肝细胞有一定的形态学保护作用；HSC-T6增殖受到抑制且具有浓度依赖性；吡非尼酮可以抑制HSC-T6中 RhoA蛋白的表达且具有浓度依赖性。