降解赭曲霉毒素A微生物菌株的筛选及其降解机制的研究

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赭曲霉毒素A(Ochratoxin A,OTA)是一种有毒的真菌次级代谢产物,主要由曲霉属(Aspergillus)和青霉属(Penicillium)产生,具有致畸、致癌、致突变等多种毒性,因此,对人和动物健康存在潜在的危害。OTA广泛存在于谷物及其制品、咖啡、水果等食物中,是一种重要的食品和饲料污染物,而葡萄及其制品中OTA的污染及危害程度被认为仅次于谷物。  利用物理方法去除OTA,如拣选未污染物、清洗污染物以及吸附处理、澄清处理毒素等,虽然在一定程度上能有效地降低食品中OTA的含量,但这些处理方法并不能真正彻底地将OTA从自然界中去除,很容易造成OTA的二次污染,因此仍然对人类健康存在较大的潜在威胁。化学方法虽然具有高效性,但安全性问题堪忧。而生物脱毒法在较温和的条件下进行,且不添加有害的化学药品,不易造成营养价值的丢失,是一种较好的脱毒方法。尤其是酵母菌,一般不产生对人体有毒有害的代谢物,安全性相对细菌更高,且遗传稳定,效价高、具有耐受逆境的能力,同时可以与化学及物理处理相容。因此酵母菌成为生物脱毒中的最优选择。  本课题筛选到两株能够降解OTA的菌株,对其进行鉴定后,进一步研究了其中一株酵母菌在不同条件下降解OTA的能力及其降解机制,同时对降解产物的毒性做了初步的研究,论文的主要研究结果如下:  1.首先建立了在水系OTA样品中以1∶1的比例添加乙醇的前处理方法,经高效液相-荧光检测法(HPLC-FLD)检测OTA回收率可以达到95%;借助建立的前处理方法和HPLC-FLD检测法,从葡萄园的土壤、枝叶中分离并筛选到两株能够降解OTA的微生物,并通过液相色谱-质谱联用(LC-MS)法对这两株菌降解OTA的效果进行了验证。  2.将分离的两株菌提取DNA后,分别对菌株B-1和Y-2的16S rDNA和5.8SrDNA-ITS序列进行测序分析,并对Y-2的形态生理学进行了鉴定,确定B-1为泡囊短波单胞菌(Brevundimonas vermicularis),Y-2为耶罗维亚酵母(Yarrowialipolytica),并建立了这两株菌的系统进化树。  3.通过OTA降解实验发现,耶罗维亚酵母Y-2在不同条件下降解OTA的能力不同,初始酵母浓度越高、初始OTA浓度越低降解效果越好,且在培养温度28℃、pH为4条件下降解速率最快;耶罗维亚酵母Y-2在葡萄汁中也有很好的OTA降解能力。  4.初步探讨了耶罗维亚酵母Y-2降解OTA的机制,证明降解可能是活细胞胞内金属酶的作用;利用HepG2细胞对降解产物的毒性进行分析,结果表明耶罗维亚酵母Y-2降解OTA的产物的毒性要小于OTA。
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