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遗传改良或基因工程是提高作物产量的有效手段之一。小麦籽粒产量及其构成因素是由多个基因控制的复杂数量性状,相关分子遗传调控机理还不清楚。因此,小麦籽粒产量候选基因的克隆及其相关研究成果不仅可以为小麦高产育种提供有自主知识产权和重要应用前景的新基因,同时也可以在阐明作物产量和种子发育的分子遗传调控机理方面进行有益的尝试。本研究根据水稻、拟南芥、玉米等植物中的研究成果,将植物细胞分裂素代谢过程中的关键基因——细胞分裂素氧化/脱氢酶(CKX)作为小麦籽粒产量的功能候选基因,通过遗传作图、基因多样性研究、表达分析等途径分析了CKX基因与小麦产量及其构成因素间可能存在的联系,取得的主要结果如下:
1.采用同源克隆结合BAC文库筛选的方法从普通小麦中国春中分离得到TaCKX5基因的gDNA和cDNA序列。序列分析表明,TaCKX5基因的开放阅读框为1596bp,编码531个氨基酸,与水稻OsCKX5基因直向同源。含有CKX因家族典型的功能位点FAD-bindingdomain,预测属于分泌蛋白,并具有糖基化位点。缺体一四体定位表明,TaCKX5布于小麦染色体3A、3B、3D上。系统发育分析表明,CKX因在植物中较为保守,禾谷类作物中直向同源的CKX基因很可能具有相似的特性与功能。
2.根据已知的水稻穗粒数基因OsCKX2基因序列,同源克隆得到与其直向同源的小麦TaCKX6基因,并对TaCKX6进行了以下研究:
(1)使用偃展1号/内乡188 RILs群体和旱选10号/鲁麦14DH群体对TaCKX6基因进行了遗传作图,作图结果表明TaCKX6在两个不同的分离群体中同时被定位于3D染色体的相同区域。在偃展1号/内乡188RILs群体中,TaCKX6-D1位于SSR标记CFD70和WMC533之间,遗传距离分别为3.7和2.0cM;在旱选10号/鲁麦14DH群体中,TaCKX6-D1位于SSR标记Xgdm72和Xgwm34之间,遗传距离分别为6.0和2.5cM,与缺体-四体定位结果一致;
(2)根据TaCKX6序列设计出了等位基因特异引物,采用PCR直接测序的方法研究了TaCKX6基因在小麦野生近缘种、农家种和现代育成品种中的等位基因多样性,通过分析TaCKX6基因在三类种质中的等位变异类型与分布频率,认为TaCKX6基因在从小麦野生近缘种到农家种的驯化过程中经历了明显的瓶颈效应;
(3)根据TaCKX6-D1不同等位变异类型的差异设计出了In-Del标记,在偃展1号/内乡188RILs群体和旱选10号/鲁麦14DH群体中进行标记一性状的关联分析发现,在两个不同遗传背景的分离群体中,TaCKX6-D1第2内含子处18bp插入/缺失的变化均与千粒重相关显著,并且在不同年际和地点间表现稳定;同样,在由115份材料构成的自然群体中仍可检测到TaCKX-D1内含子处的插入/缺失变化与粒重相关;
(4)筛选获得了TaCKX6-D1基因的一对近等基因系:R43/百农3217BC7F6和百农3217,t检验表明二者在粒长和千粒重两个性状上差异显著;
(5)采用半定量RT-PCR和Real-Time PCR方法分析了TaCKX6基因的表达模式,结果表明,与TaCKX5和TaCKX2相比,TaCKX6是在小麦籽粒发育时期特异表达的基因,并且在籽粒授粉后0-6天表达逐渐增强,此阶段正是决定粒长的关键时期,结合在近等基因系中的鉴定结果,我们认为小麦中的TaCKX6基因通过控制粒长影响千粒重。
3.采用同源克隆结合文库筛选的方法,克隆获得小麦的TaCKX2基因,并根据基因3-UTR区的一段SSR序列设计引物,开发出了目标基因的SSR标记:TaCKX2 SSR。序列分析表明,TaCKX2开放阅读框长度为1554bp,编码517个氨基酸。通过对基因的全长序列比对证明小麦TaCKX2基因与水稻OsCKX11基因直向同源(cDNA序列相似性为85.3%),而非前人根据EST报道的与水稻OsCKX6基因直向同源。利用小麦缺体-四体系将TaCKX2定位在小麦染色体7B、7D上。利用由199个株系构成的偃展1号/内乡188RILs作图群体将TaCKX2定位在7B染色体上Wmc316和Wmc276两个SSR标记之间,遗传距离分别为26.7cM和6.9cM。