论文部分内容阅读
恶性肿瘤在全世界范围内导致的发病率逐年上升,目前临床上治疗肿瘤的主要手段包括外科手术切除、放疗、化疗等。其中化疗是一种常用的治疗手段,但肿瘤选择性差,药物利用率低,在杀死肿瘤的同时也会对正常组织和器官造成损伤,导致很多病人因强烈的毒副作用而难以坚持化疗。蛋白质药物因其高效、高特异性和低毒副作用的特点近年来被越来越多地用于肿瘤治疗。尽管蛋白质药物展现出了巨大的潜力,但其临床应用仍受限于在体内不稳定、容易酶降解以及难以进入肿瘤细胞内等缺点。最近,多种纳米和微米载体被开发用来保护蛋白质药物的生物活性和实现蛋白质药物的肿瘤靶向治疗。论文第一章介绍了蛋白质药物用于肿瘤治疗的现状,着重概述了用于蛋白质包载和控制释放的各种纳米载体和微米载体系统。本论文第二章设计合成了还原响应性自发荧光的透明质酸纳米凝胶(HA NGs)用于实现治疗性蛋白质药物(细胞色素C(CC)和颗粒酶B(GrB))的高效和高选择性递送。该HANGs是用透明质酸-胱胺-甲基丙烯酸酯衍生物(HA-Cys-MA)和透明质酸-赖氨酸-四唑衍生物(HA-Lys-Tet)经反相纳米沉淀法和“四唑-烯”光点击化学交联法制备得到。动态光散射(DLS)结果显示HANGs粒径较小(150 nm),PDI为0.10,表面带负电荷(-17.6mV)。HANGs在生理环境下和模拟血液环境中稳定,能有效抑制包载的CC蛋白质药物的早释;而在模拟细胞内还原环境下(10 mM GSH)可快速降解,能在10小时内快速释放约80%的CC。而且,从纳米凝胶释放的CC表现出了与自由CC相似的酶催化活性和二级结构。MTT结果显示,包载GrB的纳米凝胶(GrB-NGs)能够有效靶向并且杀死CD44过表达的MCF-7乳腺癌细胞和A549肺癌细胞,其IC50比临床上广泛使用的化疗药物低了几千倍。体内抗肿瘤实验表明GrB-NGs在极低剂量(3.8-5.7 nmol GrB equiv./kg)时就能有效抑制皮下MCF-7乳腺癌和原位A549-luciferase肺癌的生长,同时不会带来明显的毒副作用。该纳米凝胶具有高稳定性、还原敏感性、良好的肿瘤靶向性和自发荧光等优点,在蛋白质药物的细胞内高效递送方面有很好的应用前景。为进一步提高纳米凝胶载体的肿瘤选择性和内吞进入肿瘤细胞的能力,本论文第三章设计了 EGFR和CD44双重靶向的生物响应性自发荧光的透明质酸纳米凝胶(EGFR/CD44-NGs)用来增强治疗性蛋白质药物GrB在卵巢癌和乳腺癌的靶向递送。EGFR/CD44-NGs由透明质酸-四唑衍生物(HA-g-Tet),透明质酸-四唑/GE11多肽衍生物(HA-g-GE11/Tet)以及透明质酸-胱胺-甲基丙烯酸酯衍生物(HA-g-Cys-MA)通过联用反相纳米沉淀法和“四唑-烯”光点击化学法制得。EGFR/CD44-NGs可定量包载CC和GrB,粒径较小(约165 nm),在血清中稳定,而在还原条件下快速释放包载的蛋白质药物。流式结果显示EGFR/CD44-NGs内吞进入CD44/EGFR高表达的SKOV-3细胞的量是CD44-NGs单靶向实验组的6倍多。同样,GrB-EGFR/CD44-NGs相比于GrB-CD44-NGs能更好地激活SKOV-3肿瘤细胞内的caspase,更有效地抑制细胞的生长。体内抗肿瘤实验表明GrB-EGFR/CD44-NGs在3.85 nmol GrB equiv./kg的低剂量条件下几乎完全抑制了皮下SKOV-3卵巢癌和MDA-MB-231乳腺癌肿瘤的生长,而且未引起明显的毒副作用。该治疗效果明显优于单靶向的GrB-CD44-NGs。因此,EGFR和CD44双靶向的多功能透明质酸纳米凝胶能显著增强蛋白质纳米药物内吞进入肿瘤细胞的能力,进而提高蛋白质药物的抗肿瘤效果。肿瘤转移是造成大部分癌症患者死亡的主要原因。在第四章,我们用双靶向EGFR/CD44-NGs包载蛋白质药物皂草毒素(Sap),并详细研究了载Sap的纳米凝胶(Sap-EGFR/CD44-NGs)对4T1-luciferase(4T1-luc)转移性乳腺癌的体内治疗效果。流式结果显示EGFR/CD44-NGs内吞进入CD44/EGFR高表达的4T1-luc细胞的量是CD44-NGs单靶向实验组的6.2倍。MTT结果显示Sap-EGFR/CD44-NGs能有效地抑制4T1-luc细胞的生长,其半致死浓度(IC50)为5.36 nM,这远远小于单靶向的Sap-CD44-NGs(14.4 nM)。体内抗肿瘤实验表明 Sap-EGFR/CD44-NGs 在低剂量(13.3 nmol Sap equiv./kg)的条件下有效抑制了 4T1-luc肿瘤在肺部的转移和生长,并且未表现出明显的毒副作用。这证明了该双靶向纳米凝胶在包载治疗性蛋白质药物后,可高效抑制肿瘤的转移和生长。在第五章,我们设计制备粒径均一的透明质酸微凝胶(HMGs),来实现赫赛汀(Herceptin)在卵巢癌的局部长效释放。HMGs由透明质酸的甲基丙烯酸-2-氨基乙酯衍生物(HA-AMA)和透明质酸的二甲氨基四唑衍生物(HA-MTet)经微流控法和“四唑-烯”光点击化学交联法制备得到。通过简单调节水相油相速度,可方便制备得到大小均一、粒径在25-50μm的微凝胶。HMGs在透明质酸酶的作用下会降解,并且降解速率随透明质酸酶浓度的增加而加快。HMGs能高效包载Herceptin和IgG蛋白药物,包载量可高达27.2 wt.%。体外释放实验表明HMGs可实现Herceptin和IgG的长效可控释放,在1 U/mL的透明质酸酶的条件下,Herceptin蛋白药物在10天时的释放量为80.6%。圆二色谱(CD)测试显示从微凝胶中释放出的Herceptin和IgG蛋白质具有与自由蛋白质相似的二级结构。体内抗肿瘤实验结果显示局部单剂量的Herceptin-HMGs(30 mg Herceptin equiv./kg)能显著抑制皮下 SKOV-3 卵巢癌移植瘤的增长,抑瘤率高达80.4%。该生物可降解微凝胶在蛋白质药物的局部长效可控释放方面具有较好的应用前景。第六章对本论文工作进行了全面总结,并展望了今后可开展的工作。