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小麦作为一种全球性的最重要的粮食作物之一,其产量受到日益严重的土壤盐渍化及气候改变(如加剧的干旱、高温)的影响。培育抗逆的小麦品种是提高小麦产量的有效途径。小麦的一些野生近缘种在长期的进化过程中形成了特有的适应不良环境的机制,如耐盐、抗旱、抗病虫害等,是对小麦进行遗传改良的优质基因资源。滨麦(Leymus mollis L.),属于禾本科小麦族赖草属,是一种分布于沿海海滩及贫瘠土地上的异源四倍体植物,是小麦的野生近源物种,具有良好的耐盐碱能力,被认为是一种对小麦进行遗传改良的重要遗传资源。尽管滨麦在小麦的遗传育种研究上被认为有巨大的应用价值,但是目前对滨麦的基因信息及耐逆机理知之甚少。滨麦应对盐分胁迫的生理生化反应的遗传基础还不清楚。新一代高通量测序技术能够全面快速地获得某个特定样本中几乎所有转录本的序列信息及含量。通过转录组信息能够对基因组功能元件、剪切方式、转录结构、转录后修饰、转录产物分类以及胁迫条件的差异表达进行研究,因此,转录组测序已成为研究基因表达的主要手段。本项目利用Illumina HiSeq TM 2000高通量测序技术,对盐胁迫处理和正常条件下的滨麦叶片进行转录组测序,构建滨麦的盐分响应转录组数据库。利用生物信息学手段全面系统的分析滨麦响应盐分胁迫的基因表达谱,比较了处理组和对照组样品的差异表达基因谱,具体结果如下:(1)针对滨麦的对照组和盐处理组转录组测序共得到46 154 210条和46 406704条Clean reads,采用Trinity软件将Clean reads进行组装,分别得到218 966条和228 637条Contig,N50长度分别为466bp和438 bp;将Contig进一步组装,分别得到110 323条和112 846条Unigene,N50长度分别为1 379bp和1 319bp。(2)对拼接好的Unigene进行功能注释,其中共有151,538、124,074、78,554、47,358、81,400、74,200Unigene条分别注释到Nt、NR、Swiss-Prot、COG、GO和KEGG数据库。将滨麦叶片转录组Unigene与COG数据库进行比对,得到15786条注释结果,归属于“一般功能预测”等25个大类;注释到GO数据库,共有20 350条Unigene被注释分类到“生物学过程”、“细胞组件”和“分子功能”三个大类中;比对到KEGG库,有18 550条Unigene得到注释,共涉及到128条代谢途径,其中就包含了与植物抗盐性相关的物质的代谢途径。(3)对处理组和对照组进行差异表达分析,并对筛选出的差异表达Unigene进行GO和KEGG富集分析。结果表明,滨麦中Unigene通过调节渗透压物质的积累、参与氧化酶系统调控、参与次生代谢产物通路和编码耐盐基因如Na+/H+逆向转运蛋白等多种方式来参与滨麦响应盐胁迫的生理过程。(4)对滨麦转录组中耐盐相关基因进行挖掘,共得到32条Na+转运相关蛋白基因、94条氧化胁迫响应基因。其中Na+转运相关蛋白基因的基因定位在液泡膜和质膜上,用以维持细胞内的Na+/K+平衡和渗透势。氧化胁迫响应基因用于保证细胞内的活性氧可以及时得到清除,进而减少其对细胞膜系统的损害。此外,液泡膜Na+/H+逆向转运蛋白(Na+/H+antiporter,NHX)基因是植物细胞中一类重要的耐盐基因。本研究在转录组测序的基础上,得到了滨麦液泡膜Na+/H+逆向转运蛋白2基因(LmNHX2)的c DNA序列,通过生物学软件对该基因编码的蛋白进行分析和预测,并对其响应盐胁迫的表达模式进行了分析。结果显示,LmNHX2的cDNA序列包含1617bp的开放阅读框,编码538个氨基酸。该基因编码的多肽链疏水性氨基酸占多数,具有典型的跨膜蛋白的结构特点。序列比对结果表明,LmNHX2蛋白与小麦TaNHX2、长穗偃麦草TeNHX2及大麦HvNHX1的序列高度相似,四者在进化关系上居于同一分支。荧光定量PCR结果显示,LmNHX2的表达受到盐分胁迫的诱导。