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Corynebacterium glutamicum JHI3-156是一株L-异亮氨酸高产菌株。该菌株通过多轮传统诱变筛选获得,很难再进一步通过诱变提高其L-异亮氨酸产量。本论文针对C. glutamicum JHI3-156,通过转录组学和蛋白组学分析,解析了其L-异亮氨酸的高产机制,接着对该菌株进行了一系列代谢工程改造,进一步提高了其L-异亮氨酸生产水平。主要结论如下：(1)通过新一代高通量测序技术对C. glutamicum JHI3-156;进行了转录组学分析。在发酵对数生长中后期收集C. glutamicum JHI3-156和野生菌ATCC13869,提取总RNA,用六甲基随机引物将其中mRNA反转录成cDNA并进行了测序,对两种菌株中差异表达基因进行了注释。与对照菌ATCC13869相比,C. glutamicum JHI3-156中有406个基因的转录水平上调,有237个基因的转录水平下调。KEGG pathway富集性分析发现,转录水平上调的基因主要有氨基酸代谢途径中hom和thrB,丙酸代谢途径中prpB2、prpC2、prpD2、cg2796、sucC、 sucD和dtsR1;转录水平下调的基因主要有氨基酸代谢途径中soxA、glyA、Cg2455和serC, TCA循环途径中sdhCD、icd、sdhB、acn、mdh、sdhA、fumC、gltD、gltB和glnA。(2)结合二维电泳和质谱对C. glutamicum JHI3-156进行了蛋白组学分析。在发酵对数生长中后期收集C. glutamicum JHI3-156和野生菌ATCC13869,进行全蛋白提取和二维电泳分离,每种样品均获得750个蛋白点。与对照菌ATCC13869相比,C. glutamicum JHI3-156中有82个蛋白表达水平上调,123个蛋白表达水平下调；181个蛋白仅在ATCC13869中表达,而197个蛋白仅在JHI3-156中表达。从ATCC13869和JHI3-156中分别选取了13和18个蛋白点进行了MALDI-TOF质谱鉴定,确定了下列表达水平变化较大的蛋白：MetX、 PrpC2、Sod、Gnd、CysK、FusA和SerS。(3)通过异源表达纯化,发现C. glutamicum JHI3-156的苏氨酸脱水酶(TD1)和乙酰羟基氨酸合酶(AHAS1)均具有抗反馈抑制能力。通过蛋白质序列分析发现,与野生菌ATCC13869的苏氨酸脱水酶(TD)和乙酰羟基氨酸合酶(AHAS)相比,C. glutamicum JHI3-156的TD1有一个氨基酸突变(F383V),而JHI3-156的AHAS1有3个氨基酸突变(P176S、D426E和L575W)。将TD、TD1、AHAS和AHAS1在Escherichia coli BL21(DE3)中过量表达、提取纯化和酶活测定。与TD相比,TD1酶活水平提高,而且完全耐受L-异亮氨酸的抑制；与AHAS相比,AHAS1也能耐受较高的L-异亮氨酸抑制。在C. glutamicum JHT3-156中过量表达TD1或AHAS1均能提高L-异亮氨酸产量。3L发酵罐补料分批培养72h后,JHI3-156/pDXW-8-ilvBN1-ilvA1中的L-异亮氨酸产量由24.3g·L-1提高至30.7g·L-,比对照菌提高了26.3%。(4)通过改善产物分泌系统,提高C. glutamicum JHI3-156的L-异亮氨酸生产效率。在穿梭表达载体pDXW-8上单个或组合克隆了双组分分泌系统BrnFE操纵子和全局调控因子Lrp,构建了重组菌JHI3-156/pDXW-8-brnFE、JHI3-156/pDXW-8-lrp和JHI3-156/pDXW-8-lrp-brnFE。通过对这些重组菌株的L-异亮氨酸生产分析比较,发现单个表达lrp比表达brnFE能生产更多的L-异亮氨酸,当lrp和brnFE共表达时可显著提高L-异亮氨酸的产量。3L发酵罐补料分批培养72h后,JHI3-156/pDXW-S-lrp-brnFE中的L-异亮氨酸由24.3g·L-1提高至26.9g·L-1,比对照菌提高了11.0%,L-异亮氨酸对菌体的得率提高了72%。RT-PCR分析表明,lrp的表达不仅可提高brnFE的转录水平,还可提高L-异亮氨酸生物合成途径关键基因lysC、hom、thrB、 ilvA和ilvBN的转录水平。(5)综合优化合成途径、分泌系统和辅酶供给,进一步提高C. glutamicum JHI3-156中L-异亮氨酸生产效率。构建了重组菌JHD-156/pDXW-8-ppnk1-lrp-brnFE、JHI3-156/pDXW-8-ilvBN1-ilvA1-lrp-brnFE、JHB-156/pDXW-8-ilvBNU1-ilvA1-ppnk1和JHI3-156/pDXW-8-ppnk1-ilvBM-ilvA1-lrp-brnFE。通过测定L-异亮氨酸产量和关键酶酶活,发现与对照菌JHD-156/pDXW-8相比,四种重组菌L-异亮氨酸的产量都得到了提高,其中提高幅度最大的是JHI3-156/pDXW-8-ilvBN1-ilvA1-ppnk1。3L发酵罐补料分批培养72h后,JHI3-156/pDXW-8-ilvBN1-ilvA1-ppnk1中的L-异亮氨酸产量由24.3g·L-1提高至32.3g·L-1,比对照菌提高了32.9%。