基于自吸分液式数字PCR芯片的单细胞内生物分子计数研究

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细胞作为生物体结构和功能的基本单位,对其基因组和转录组进行分析在研究分化、发育、疾病起源等方面都具有重要意义。目前对细胞遗传物质分析仍局限于对大量细胞进行分析获得平均结果,忽略了细胞间的异质性,也使得在细胞群体中数量稀少的细胞的特性被掩盖。所以,单细胞水平的基因分析亟待进一步研究。本论文对单细胞基因组、转录组的分析方法和单细胞内蛋白质的分析方法进行了综述,着重对基于微流控技术的单细胞分析方法进行了详细阐述。在此基础上,本论文使用自主研发的自吸分液式数字聚合酶链式反应(Polymerase Chain Reaction, PCR)芯片对单个A549细胞内的18sRNA基因、持家基因β-actin、非小细胞肺癌相关基因PLAU进行了数字PCR检测,优化了纳升级的单细胞数字PCR反应的反应体系及反应条件,并将定量的范围扩展到了单细胞内的蛋白质分子,对单细胞内EGFR蛋白质的含量进行了测定,取得了以下创新性结果:(1)基于微流控芯片的数字PCR方法,成功地对单个细胞内的核酸分子进行精确定量,对单细胞内非小细胞肺癌相关基因PLAU的检测说明单个细胞之间存在差异;(2)基于微流控芯片的数字亲和连接反应(Proximity Ligation Assay, PLA)方法,成功地实现了对单细胞内的蛋白质分子的精确定量,将微流控芯片的应用从单分子核酸定量扩展到了蛋白质定量。以上的结果可为疾病起源的研究、重大疾病的早期诊断、产前诊断、细胞的分化和发育研究等提供一种重要的工具,可进一步建立单细胞内核酸分子与蛋白质分子的关联性研究,为单细胞基因组、转录组、蛋白质组等提供新的技术方法。
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