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背景和目的:在以前的研究中,我们证实rMuc3羧基端于合成早期即在内质网内发生了酶切,酶切位点位于LSKGSIVV基序的GS位点。30kDa的氨基端片段并没有脱落,而是与49kDa的羧基端片段以SDS或热敏感的非共价键连接在一起共同锚定在细胞膜上。酶切以及酶切后片段相互连接的生物学意义目前尚不清楚,可能有利于后续可溶性的细胞外区域释放至肠腔。我们同时发现rMuc3羧基端SEA组件的酶切需要LSKGSIVV基序后续较远肽段的参与,片段的连接需要完整的SEA组件,而与N型糖基化无关。进一步我们发现,49kDa的膜锚定片段经历了二次酶切,产生30kDa片段,并经Western blotting,免疫沉淀和N-glycosidase F脱糖基化检测和证实了酶切产物。两次酶切的发生可能有利于Muc3在肠上皮细胞表面形成可分泌形式和（或）参与肠上皮细胞表面受体、配体的识别进而参与体内细胞信号转导。但LSKGSIVV基序的酶切是蛋白酶介导的酶切还是自酶切,目前尚不清楚。探索酶切的机制对于rMuc3及其他包含SEA组件的蛋白质有非常重要的意义。最近证实,MUC1内SEA组件的酶切是自酶切,并进一步阐明了其酶切的机制。但MUC1内SEA组件的104个氨基酸残基与rMuc3SEA组件174个氨基酸残基同源性非常低（仅6.9%）,因此,MUC1SEA组件的酶切方式不能类推至rMuc3等其他粘蛋白。本课题即是进一步证实我们以前发现的rMuc3羧基端SEA组件LSKGSIVV基序的酶切方式,并探索这种蛋白质翻译后修饰发生的生物学意义。方法:1、含目的蛋白原核表达载体的构建、表达在以前的研究中,我们已构建了含rMuc3羧基端381个氨基酸的p20、p20G/A真核表达载体。在本实验中我们以p20、p20G/A质粒为模板,采用PCR方法获得含rMuc3羧基端381个氨基酸目的片段,将此片段插入N端含His标签的pQE30原核表达载体中,命名为pQE30-Muc3和pQE30-Muc3（g/a）。将pQE30-Muc3和pQE30-Muc3（g/a）转化宿主菌M15,重组菌在含100mg/L氨苄青霉素和50 mg/L卡那霉素的LB培养基中加入IPTG （终浓度1Mm）37℃诱导获得目的蛋白表达,Western blotting检测表达蛋白,以在原核细胞水平探讨大鼠Muc3分子羧基端SEA组件的酶切情况。2、pQE30-Muc3（g/a）表达蛋白的纯化和体外孵育pQE30-Muc3（g/a）表达蛋白采用Ni-NTA agarose纯化。将转化pQE30-Muc3（g/a）的重组菌诱导后超声破菌,超声上清与Ni-NTA agarose在4℃摇床上共孵育2小时,上柱,蛋白检测仪监测纯化过程,依次用裂解缓冲液、洗涤缓冲液1、洗涤缓冲液2洗柱,最后用洗脱缓冲液洗脱,从而获得目的表达蛋白。分别取纯化蛋白在37℃水浴孵育4、8、16、24、36和48小时,Western blotting检测孵育蛋白,观察纯化蛋白孵育后的酶切情况。3、SEA组件的完整性对酶切发生的影响利用ClustalX对多个含SEA组件的蛋白质进行序列比对,获得p20t后续保守的氨基酸残基位点,分别为174位丝氨酸,201位半胱氨酸,212位酪氨酸和223位酪氨酸。采用定点突变技术,设计相应突变引物,以p20SEA为模板,基于PCR扩增得到不同含终止密码子的不完整SEA组件突变体,并经测序验证后,利用阳离子脂质体Lipofectamine2000将各突变体及p20、p20SEA瞬时转染入COS-7细胞中,通过Western blotting检测各突变体的酶切发生情况,以发现新的、未证实的SEA后续79个氨基酸中对构象的维持及酶切的发生起关键作用的多肽序列。4、rMuc3SEA组件的分子模建人MUC1和CA125（鼠muc16的同系物）SEA组件的晶体结构已通过NMR获得,rMuc3SEA组件与二者有一定的同源性,利用生物信息学知识,运用SGI insightII工作站中的homology模块对rMuc3SEA组件进行同源性模建,获得rMuc3羧基端SEA组件的3D结构图,从结构上进一步分析SEA组件内酶切发生的结构基础,丰富SEA组件酶切方式的物质内涵。5、将不同酶切状况的真核表达载体稳定转染Lovo细胞,转染及表达鉴定后流式细胞仪观察转染后细胞G2/M比例及凋亡情况,划痕实验观察细胞在机械性损伤后迁移情况,Transwell小室实验观察细胞侵袭能力,以初步探讨酶切发生的可能的生物学意义。结果:1、获得pQE30-Muc3和pQE30-Muc3（g/a）原核表达载体,转化宿主菌,重组菌在37℃、IPTG终浓度为1mM诱导条件下可见目的蛋白表达,Western blotting检测发现表达产物中包括55kDa的全长的rMuc3羧基端分子,该分子同时可以被V5和Myc抗体所识别;49kDa的仅能被Myc抗体所识别,但不能被V5抗体所识别的酶切后的羧基端片段;30kDa的仅能被V5抗体所识别,但不能被Myc抗体所识别的酶切后的氨基端片段。这表明在细菌中rMuc3羧基端也如真核细胞中一样发生了酶切。一般来说,细菌中不可能存在能酶切真核细胞中表达而细菌中不表达的rMuc3蛋白羧基端的特异性蛋白酶。这一研究为rMuc3SEA组件的酶切是自酶切这一假设提供了初步证据。2、pQE30-Muc3（g/a）原核表达蛋白纯化后37℃水浴孵育,Western blotting时用N端V5抗体检测发现在4小时、8小时只可见大小约55kDa的全长片段,16小时可见大小约55kDa的全长片段减少而30kDa酶切后片段明显增加,随着孵育时间的延长,全长片段未检测到,纯化蛋白仅为30kDa的酶切后片段。这个发现更让我们肯定rMuc3SEA组件在无其他外源性蛋白的影响下发生进一步酶切。随着孵育时间的延长,N端30kDa片段是唯一的裂解片段,排除了rMuc3羧基端纯化蛋白降解的可能。因此,我们认为rMuc3羧基端SEA组件的酶切是自酶切。3、将研究的rMuc3羧基端保守的第174位丝氨酸、201位半胱氨酸、212位酪氨酸、223位酪氨酸分别突变为终止密码子后,瞬时转染COS-7细胞,产生一组截短的rMuc3羧基端蛋白并分泌至培养基中。培养上清行N端V5抗体Western blotting检测,可见在201位半胱氨酸、212位酪氨酸、223位酪氨酸突变后均可见大小约30kDa的酶切后片段。因此推测174-201的氨基酸序列对维持SEA组件的正常构象非常重要,从而保证rMuc3SEA组件自酶切的发生。4、模建的结构提示rMuc3SEA组件是由四个α螺旋和四个β片层组成的结构域,没有无规卷曲,与人MUC1SEA组件的晶体结构非常相似,酶切基序位于β2和β3之间的转角处。SEA组件内174S至201C的氨基酸序列位于α4与β4形成的转角上,且在空间上与酶切基序的位置非常靠近。可能这正是174S至201C的氨基酸序列影响自酶切的原因所在。rMuc3羧基端SEA组件的分子模建为我们提供了理解rMuc3SEA组件自酶切发生的结构信息。5、rMuc3羧基端稳定转染人Lovo细胞（该细胞表达截短形式的MUC3,缺乏MUC3的胞浆尾部,因此Lovo细胞中MUC3的功能肯定受影响）后,流式细胞仪检测显示,Lovo/p20组进入G0/G1期细胞减少,而进入S期和G2/M期的细胞较其他组明显增加,差异有统计学意义（p<0.05）, Lovo/p20G/A组、Lovo/p20S/A组、Lovo/pSec及未转染组之间无明显差异（p>0.1）;Lovo/p20组穿越Matrigel“屏障”浸润的细胞数显著增加,与Lovo/p20G/A、Lovo/p20S/A、Lovo/pSec及未转染组相比差异有统计学意义（p<0.05）,而Lovo/p20S/A、Lovo/pSec及未转染组之间差异不明显（p>0.1）;细胞划痕实验结果显示, Lovo/p20组培养24 h时,细胞向“伤口”迁移的细胞数多于Lovo/p20G/A, Lovo/p20S/A, Lovo/pSec及未转染组,Lovo/p20组1. 9±0.63与Lovo/p20G/A组（1. 16±0.41）, Lovo/p20S/A组（0.85±0.41）,Lovo/pSec组（1.15±0.44）组相比差异有统计学意义（P<0. 05）,Lovo/p20G/A组、Lovo/p20S/A组、Lovo/pSec组及未转染组之间无明显差异（p>0.1）。这些发现提示rMuc3SEA组件的自酶切可能掌控该蛋白功能的发挥。结论:1.在原核细胞表达水平和原核表达蛋白纯化后体外孵育水平均证实大鼠Muc3分子羧基端SEA组件发生酶切,结合前期在真核水平的研究结果和酶切位点的结构特点,表明该酶切的发生是没有蛋白酶介导的自酶切的结果。2.应用定点突变技术研究SEA组件后续79个氨基酸对酶切的影响时发现羧基端174位丝氨酸至201位半胱氨酸之间的氨基酸序列对于酶切的发生非常重要,可能在维持SEA组件的正常三维结构起关键性的作用,从而触发酶切的发生。3.rMuc3SEA组件蛋白质分子模建的发现从结构上为我们提供了rMuc3SEA组件自酶切发生的必然性。4.体外实验发现,rMuc3SEA组件的自酶切可能掌控其功能的发挥,在体外实验中能促进细胞增生,增强细胞迁移和侵袭,从而影响细胞的生物学行为。