论文部分内容阅读
药用昆虫资源丰富,种类繁多,长久以来在帮助人类治疗疾病与提高生命质量方面具有突出贡献。有效利用药用昆虫资源,对我国天然药物的发展和药用昆虫资源开发与应用有着十分重要的意义。本文选取喙尾琵琶甲(Blaps rynchopetera Fairmaire)作为研究对象,这是一种云南地区历史悠久的药用昆虫。在民间,喙尾琵琶甲一般用于治疗发烧感冒、胃炎、咳嗽、肿瘤等病症,能够起到缓解炎症、解毒消肿等功效。为了明确喙尾琵琶甲的活性物质基础,尤其是其在抗炎、抗肿瘤及抗氧化方面的活性成分,本研究采用活性导向的思路,综合现代高效分离和体外活性研究手段,建立了活性成分快筛方法,为喙尾琵琶甲的药物开发与利用提供了理论依据。本文首次采用脉冲超声提取法对喙尾琵琶甲(500g)进行活性成分低温快速提取,并对各组分进行了定性研究。根据溶解性和极性的不同,分别制得喙尾琵琶甲的四个粗提物组分:油脂部A(28.54g)、85%乙醇提取组分B(27.78g)、水提醇沉组分C(29.35g)和水溶组分D(24.56g)。油脂部位A采用GC-MS进行了成分分析,鉴定出21种化学成分,其中棕榈酸和亚油酸是其主要成分,其含量分别占总含量的41.59%和43.91%。对85%乙醇组分B进行分段萃取得到石油醚部位B1、乙酸乙酯部位B2、正丁醇部位B3和水部位B4粗提物。通过双缩脲反应、茚三酮反应和α-萘酚反应(Molisch反应)对B、C、D、B1、B2、B3和B4部位进行主要大类成分定性鉴别。结果表明所有部位均含有肽类或蛋白质成分,B、D、B3和B4部位含有氨基酸或氨基肽,B、C、D、B2和B3部位含有糖类成分。其次,根据喙尾琵琶甲的药用历史,选择了三种体外活性模型作为活性成分筛选的指标:经典炎症细胞模型中的小鼠单核/巨噬细胞系(RAW264.7)、抗肿瘤细胞模型中的肝癌细胞系(Hep G2)和常用的ABTS+·及DPPH·自由基清除抗氧化模型。结果显示:在抗炎活性方面,A部位对RAW264.7有增殖作用,B、C和D部位对RAW264.7均有抑制作用,其中B部位的抗炎作用的主要成分集中在B2部位,且B2抗炎作用较B部位相比具有显著增强。在抗肿瘤活性方面,B部位对Hep G2有抑制作用,其中B部位的抗肿瘤作用的主要成分集中在B2部位,且B2部位抗肿瘤作用较B部位有显著增强。抗氧化活性方面,与阳性对照药维生素C相比,喙尾琵琶甲A、B、C和D各部位对DPPH·自由基的清除能力由大到小的顺序为:Vc(IC500.020mg/m L)>D(IC500.097mg/m L)>B(IC500.147mg/m L)>C>A。喙尾琵琶甲B1、B2、B3和B4各部位对DPPH·自由基的清除能力由大到小顺序为Vc(IC500.020mg/m L)>B2(IC500.024mg/m L)>B3>B1>B4,其中B2部位的抗氧化活性与阳性对照Vc相当,在同一数量级水平。喙尾琵琶甲A、B、C和D各组分对ABTS+·清除能力由大到小的顺序为:Vc(IC50 0.006mg/m L)>D(IC50 0.028mg/m L)>B(IC50 0.061mg/m L)>C>A,喙尾琵琶甲B1、B2、B3和B4各部位对ABTS+·自由基的清除能力由大到小顺序为B2(IC500.005mg/m L)>Vc(IC50 0.006mg/m L)>B3(IC500.111mg/m L)>B1(IC500.183mg/m L)>B4(IC500.193mg/m L),其中喙尾琵琶甲B2部位ABTS+·自由基清除率IC50值0.005mg/ml,此结果与阳性对照Vc对ABTS+·自由基清除效果基本一致。综上,本研究通过活性导向的方法首次明确了B2是喙尾琵琶甲主要的抗炎、抗肿瘤和抗氧化活性部位。最后,针对喙尾琵琶甲主要活性部位B2的活性物质基础探究,本研究建立了以高速逆流色谱法为主要手段的快速分离及活性组分富集方法。通过进一步活性导向的细分及筛选,明确了B2部位的主要活性馏分编号1516,结合柱色谱分离技术,得到活性单体化合物羟基酪醇及4-乙基间苯二酚。经验证羟基酪醇在浓度为12.5μg/m L,时间为72h对RAW264.7细胞和Hep G2细胞的最大抑制率分别是81.34%和67.76%,具有较好的抗炎和抗癌活性。羟基酪醇对DPPH·和ABTS+·自由基清除率的IC50值分别为0.027mg/m L和0.003mg/m L,与阳性对照Vc对DPPH·和ABTS+·自由基清除率的IC50值(0.020mg/m L和0.006mg/m L)相比较,较为接近,具有较强的抗氧化活性。而4-乙基间苯二酚在浓度为200μg/m L,时间为72h对RAW264.7细胞的最大抑制率是75.35%,具有较好的抗炎活性。4-乙基间苯二酚对DPPH·和ABTS+·自由基清除率的IC50值分别为0.038mg/m L和0.0025mg/m L,同样具有较强的抗氧化活性。