多聚半乳糖醛酸酶的克隆表达

来源 :大连海洋大学 | 被引量 : 0次 | 上传用户:long_drago
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果胶酶作为降解果胶重要的生物催化剂,在食品、纺织、污水处理等工业领域都有广泛应用,果胶酶来源广泛,细菌、真菌、动植物等都有发现,但是由于低活性等原因限制了其大规模工业化。因此筛选果胶降解新菌株及酶有重大意义,可为生产商业化果胶降解酶提供基础。本论文研究主要结果如下:1.从实验室的环境和腐烂的软枣猕猴桃中筛选获得5株可以降解果胶的菌株。其中菌株D-7发酵液活性为0.14 U/m L,对菌株D-7进行形态和系统生物学分析,将菌株D-7鉴定为新拟盘多毛孢菌,命名为Neopestalotiopsis clavispora D-7。2.以Neopestalotiopsis clavispora D-7为研究对象,依据NCBI和CAZY数据库对其基因组注释的结果,找出多聚半乳糖醛酸酶的基因信息,命名为Nc GH28A。基因Nc GH28A有1185 bp,编码394个氨基酸,理论分子量为41.38 k Da,等电点为4.25,存在5个潜在的N-糖基化位点和2个潜在的O-糖基化位点。根据Nc GH28A的基因信息,利用克隆技术获得Nc GH28A目的基因,构建到质粒p PICZαA上,电转化至毕赤酵母X-33进行胞外异源表达,未获得含有6×His标签的重组蛋白质Nc GH28A。3.以晶体结构(1HG8)已经被注释,且酶活性较好的来源于Fusarium moniliforme的多聚半乳糖醛酸酶为研究对象,利用NCBI数据库的Blast比对工具,以该蛋白质序列为模板进行比对,找到与其蛋白质序列同源性为83%的来源于Fusarium austroafricanum的多聚半乳糖醛酸酶序列,并命名为Fa PG。Fa PG长1122bp,编码373个氨基酸,理论分子量为38.7 k Da,等电点为6.46,存在2个潜在的N-糖基化位点和2个潜在的O-糖基化位点。根据Fa PG的基因信息,利用克隆技术获得Fa PG目的基因,连接到质粒p Cold TF上,转化至大肠杆菌BL21(DE3)进行胞内异源表达。获得含有Trigger Factor标签的重组蛋白质Fa PG,使用镍柱亲和层析对粗酶进行纯化后获得较纯的Fa PG。利用Thrombin酶切除多聚半乳糖醛酸酶Fa PG的Trigger Factor标签,酶切后的Fa PG活性为0.051 U/mg,表明其有微弱的降解果胶能力。
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