副溶血弧菌(Vibrio parahaemolyticus)是导致食源性细菌感染的重要病原，人类误食该菌污染的海鲜可产生食物中毒症状，因此检测海产品中的副溶血弧菌对减少副溶血弧菌感染具有重要意义。传统的检测方法程序复杂，包括细菌富集、选择性分离、生化鉴定和分子生物学鉴定，这种方法耗时、灵敏度低且劳动强度大。为减少副溶血弧菌感染进一步传播的风险，需要更快速灵敏的副溶血弧菌富集和检测方法。本研究建立了一种快速有效的IMS-RPA-LFD方法，其原理是将免疫磁分离技术、重组酶聚合酶扩增方法及侧流层析技术结合用于检测副溶血弧菌，该方法操作相对简单、灵敏度高，同时可以节省大量的细菌富集和检测时间，为检测副溶血弧菌提供了一种简单便捷的方法。
　　1副溶血弧菌IMS快速富集方法的建立
　　为建立用于富集副溶血弧菌的免疫磁分离(immunomagnetic separation，IMS)技术，将单克隆抗体1-1-D12与粒径为750nm的超顺磁颗粒PM3-050经相应化学试剂催化偶联后制备免疫磁珠，随后对制备的免疫磁珠进行抗体用量、缓冲液、反应时间及免疫磁珠用量等优化，并测定了免疫磁珠的特异性及其在不同副溶血弧菌浓度下的捕获能力。结果显示，本次制备的免疫磁珠最佳抗体偶联量为300μg/mg，在磁珠最佳使用条件下，其检测限低至菌液浓度为70CFU/mL，最大捕获量为9.95×104CFU/mg，且捕获时间仅需45min;特异性试验结果表明该免疫磁珠除捕获副溶血弧菌捕获率超过60％以外，其余细菌捕获率均低于10％。以上结果表明，所建立的免疫磁分离技术能够有效分离副溶血弧菌，且简便快速、灵敏度高、特异性好。
　　2副溶血弧菌RPA-LFD快速检测方法的建立
　　为建立针对副溶血弧菌的重组酶聚合酶扩增(recombinase polymerase amplification，RPA)与侧流层析试纸条(lateral flow dipstick，LFD)结合的快速检测方法RPA-LFD，根据副溶血弧菌特异性基因(登录号:NC_004605.1)设计引物，使用RPABasic试剂盒对引物进行简单筛选，之后根据该引物设计试验探针并建立RPA-LFD方法，对建立的方法进行了反应温度与反应时间的优化，最后测定了RPA-LFD的敏感性和特异性。结果显示，建立的副溶血弧菌RPA-LFD快速检测方法总的反应时间仅需25min，最佳反应温度为37℃。通过使用不同菌株对该方法进行性能测定，发现该方法检出限为10pg/μL，且该方法除副溶血弧菌外不与其他细菌反应，表示RPA-LFD方法敏感性与特异性较好，适合用于副溶血弧菌样品的快速检测。
　　3IMS与RPA-LFD结合用于贻贝模拟样品中副溶血孤菌的快速检测
　　为建立用于快速富集及检测副溶血弧菌的IMS-RPA-LFD方法，将免疫磁珠分离技术与重组酶聚合酶扩增、侧流层析技术结合，用来检测副溶血弧菌。将连续稀释的副溶血弧菌菌液添加到贻贝样品中制备模拟样品，使用制备好的免疫磁珠在最优条件下对不同时间段的样品进行捕获，提取富集后该菌的DNA使用RPA-LFD进行检测，并将IMS-RPA-LFD与IMS-PCR-AGE两种方法作比较。结果显示，在贻贝模拟样品含菌量较低(2.0×10-1-2.0×102CFU/mL)的情况下IMS-RPA-LFD依然可以在5-6h内检测出副溶血弧菌;与IMS-PCR-AGE比较，在贻贝模拟样品含菌量为2.0×10-1-2.0×104CFU/mL时，IMS-RPA-LFD用时较短，比一般检测程序要快速，适用于海水样品及海鲜中的副溶血弧菌检测。