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前言：
近年来,随着人口老龄化的社会进展,神经退行性疾病越来越受到人们的关注。阿尔茨海默病(Alzheilners disease,AD)是一种中枢神经系统原发性退行性疾病,是老年痴呆中最常见的类型,其主要的病理特征是:(1)在神经元外,β淀粉样蛋白(β-amyloidpeptides,Aβ)沉积形成老年斑(senile plaque,SP);(2)在神经元内,tau蛋白异常磷酸化形成的神经原纤维缠结(neuro fibrillary tangles,NFT);(3)神经元的丢失等。AD发病机制复杂,至今尚未完全清楚。
许多研究证实,脑内金属离子代谢的异常参与AD的病理过程。在AD患者脑内可观察到过量的铁离子在SP和NFT内聚集,以及铁离子诱导的氧化应激。在AD病理生理过程中,铁离子的异常增高主要有两方面作用:一方面,铁离子的聚集直接导致金属催化蛋白质氧化分子的破坏和有丝分裂信号的异常;另一方面,铁离子增高促进Aβ的产生、沉积和级联反应,同时也促进磷酸化tau蛋白的聚集。由于铁离子和多种代谢过程有着密切联系,所以,脑铁代谢失调能够对神经功能产生不利的影响。
哺乳动物细胞转运铁有两种途径:一种是通过转铁蛋白(trans ferrin,Tf)—转铁蛋白受体(trans ferrinreceptor,TfR)途径;另一种是通过非转铁蛋白结合铁(non-transferrin-boundiron,NTBI)途径。非转铁蛋白结合铁(NTBI)途径主要是通过二价金属转运体1(divalentmetaltransporter1,DMT1)将铁离子转运至细胞内。DMT1对二价金属离子Fe2+,Zn2+,Mn2+,Co2+,Cd2+,Cu2+,Ni2+和Pb2+的运输都具有活性,尤以转运二价铁离子为主。DMT1是一个质子金属离子转运蛋白,在神经元细胞膜均有表达。DMT1有12个跨膜结构域,能够将外环境的二价金属离子向细胞内转运。发生在mk小鼠和Belgrade大鼠DMT1基因的G185R位点自发突变,引起铁离子吸收障碍,造成小细胞低色素性贫血。DMT1这种突变导致的铁离子运输障碍,能对1-甲基4苯基-1,2,3,6-四氢吡啶(MPTP)诱导的多巴胺能神经元死亡产生保护作用。近年来,我们已经报道,DMT1在APP/PS1转基因鼠脑内表达上调,并且,体外实验结果显示,DMT1基因沉默能减少铁的内流,进而抑制淀粉样过程和Aβ的分泌。总之,DMT1成为治疗AD的潜在目标。
ebselen(中文名字,依布硒林,也称为PZ51,英文名2-phenyl-1,2-benzisosenazol-3(2H)one,分子式C13H9NOSe,分子量274.28)是一种脂质水溶性低分子量硒基有机化合物,具有抗氧化活性和抗炎性。特别重要的是,大量证据证实,ebselen具有神经保护作用,目前还处于临床前期研究阶段,而且,近年来已有报道显示,ebselen是DMT1运输铁离子的抑制剂。因此,我们推测ebselen可能通过抑制DMT1运输铁离子作用,而成为潜在的抑制铁诱导tau蛋白磷酸化的抑制剂。在本研究中,以人类神经母细胞瘤(humanneuroblastoma)SH-SY5Y细胞作为体外研究对象,给予ebselen处理,对tau蛋白磷酸化和相关信号通路进行评估。
实验材料和方法：
SH-SY5Y细胞培养,待细胞进入生长期按如下分组处理:对照组——未加处理因素,换无血清DMEM培养液;FeSO4组——FeSO450μM作用细胞24h;FeSO4+Ebsden组——Ebselen5μM预处理细胞12h,FeSO450μM作用细胞24h:
Ebselen组——Ebselen5μM作用细胞12h。一、Ebselen对铁诱导的SH-SY5Y细胞tau蛋白磷酸化的影响
1、细胞种植在96孔板,给予不同剂量ebselen和FeSO4处理细胞,用MTT法对细胞活力进行测量。
2、采用WesternBlot检测各组细胞内tau蛋白磷酸化蛋白表达水平。
3、采用流式细胞分析术,用DHE作为ROS荧光探针测量各组细胞内ROS含量。
4、采用铁依赖性细胞内Calcein荧光淬灭法分析ebselen预处理SH-SY5Y细胞的二价铁离子内流。
二、Ebselen对tau蛋白磷酸化相关信号通路的的影响
1、用WesternBlot探测SH-SY5Y细胞中p-CDK5、CDK5、p35和p25蛋白表达水平。
2、用WeternBlot检测SH-SY5Y细胞中p-GSK3β和GSK3β蛋白表达水平。
实验结果：
一、Ebselen抑制铁诱导SH-SY5Y细胞的tau蛋白磷酸化
用MTT法对细胞活力进行分析,从中选择FeSO4和ebselen最佳的处理浓度,避免实验进行中细胞的死亡效应。根据MTT方法筛选,我们选择FeSO4作用浓度和时间分别是50μM和24h,ebselen作用浓度和时间分别是5μM和12h。为了研究ebsden是否能影响铁诱导的细胞内tau蛋白磷酸化,本实验以铁离子处理的SH-SY5Y细胞作为研究模型,采用WesternBlot方法检测ebselen预处理铁诱导的细胞内tau蛋白磷酸化水平。定量分析结果显示,总tau蛋白水平在各组之间并没有显著性改变;与对照组相比,FeSO4组细胞内tau蛋白在磷酸化Thr205、Ser396和Thr231位点显著升高分别为261.73±9.88%(p＜0.001),233.94±10.33%(p＜0.001)和211.44±26.86%(p＜0.05)。更重要的是,与FeSO4组相比,ebselen预处理后显著降低tau蛋白磷酸化水平,分别是Thr205位点33.11±5.21%(p＜0.001),Ser396位点44.05±4.44%(p＜0.001)和Thr231位点39.14±2.41%(p＜0.05)。这些数据说明,ebselen能抑制铁诱导SH-SY5Y细胞的tau蛋白磷酸化。
二、Ebselen减少铁诱导的SH-SY5Y细胞内ROS产生
目前已有报道证实,ebselen抗氧化特性具有神经保护作用;并且,ROS产生与铁离子诱导的神经毒性密切相关。因此,我们通过检测SH-SY5Y细胞中ROS含量,观察ebselen对二价铁离子诱导的ROS产生的影响。
采用流式细胞分析术分析结果显示,与对照组相比,FeSO4处理能显著增加细胞中ROS267.53±38.14%(p＜0.001)的产生;ebselen预处理后较FeSO4组细胞内ROS减少40.99±5.66%(p＜0.001),提示ebselen降低铁诱导的SH-SY5Y细胞内ROS产生。
三、Ebselen抑制二价铁离子的细胞内转运
为了验证ROS产生的减少是否是ebselen对DMT1的抑制作用导致,我们用CalceinAM荧光染料来衡量SH-SY5Y细胞二价铁离子的流入。荧光分光光度计测定结果表明,FeSO4对Calcein的荧光淬灭具有时间依赖性。值得注意的是,ebsden处理的细胞荧光淬灭时间与对照组细胞比较显著延迟,给予二价铁离子螫合剂BIP能逆转这种FeSO4引起的荧光淬灭,表明ebsden处理导致细胞中的二价铁离子吸收减少。
四、Ebselen抑制铁诱导SH-SY5Y细胞内CDK5和GSK3β的活性
为了进一步分析ebselen抑制tau蛋白磷酸化的机制,本实验对tau蛋白磷酸化相关激酶活性进行检测。采用免疫印迹方法检测FeSO4和/或ebselen处理对各组细胞内p-CDK5和CDK5蛋白表达水平的影响。结果显示,各组细胞内CDK5蛋白质水平未发生显著变化:与对照组相比,FeSO4组细胞内p-CDK5/CDK5比值显著增高220.19±31.10%(p＜0.01),给予ebselen预处理后较FeSO4组细胞内p-CDK5/CDK5比值降低41.58±8.30%(p＜0.001)。
另据报道,p35裂解p25片段导致CDK5活性异常,引起tau高度磷酸化。因此,我们又对FeSO4和或ebselen处理的SH-SYSY细胞内p35和p25的表达水平进行了检测。免疫印迹结果显示,FeSO4和或ebselen处理未改变细胞内p35水平。但是,与对照组相比,FeSO4组细胞内p25/p35比值显著增加(263.28±22.51%)(p＜0.001),ebselen预处理能显著降低FeSO4引起的细胞内p25/p35比值(p＜0.001)的增加。
此外,我们用免疫印迹方法对tau蛋白重要的磷酸化激酶GSK3β活性也进行了检测。结果显示,各组细胞内GSK3β未发生显著变化。但是,与对照组相比,FeSO4处理组细胞内p-GSK3β(Ser9)/GSK3β比值显著降低,给予ebselen预处理后p-GSK3β(Ser9)/GSK3β水平增加了322.99±53.79%(p＜0.001)。以上这些数据表明,ebselen能够抑制二价铁离子诱导的SH-SY5Y细胞内CDK5和GSK3β活性。
结论：
1、Ebselen通过抑制DMT1对二价铁离子的细胞内转运,减少SH-SY5Y细胞内ROS的产生,并降低tau蛋白磷酸化水平。
2、Ebselen可能通过作用于CDK5/p25信号通路,抑制了二价铁离子处理的SH-SY5Y细胞CDK5和GSK3β活性,从而降低tau蛋白磷酸化。