胃癌发病率在我国很高，死亡率居恶性肿瘤之首。胃癌的主要治疗手段是胃癌根治术，术后5年生存率为大概为32％～40％，其中约30％～50％的患者发生腹膜转移，是导致患者死亡的重要原因。胃癌腹膜转移的过程为：癌细胞浸透胃浆膜，向腹腔脱落，进而与腹膜粘附着床，增殖形成癌结节。转移病灶一旦形成，治疗十分困难。近年来提出了恶性肿瘤微转移概念，即肿瘤细胞散播并存活于腹腔、淋巴结、外周血及骨髓及其他各组织器官中，却又尚未形成转移结节。根据这一概念，在术前或术中检出脱落的癌细胞，进而采取有效的阻断治疗，成为提高疗效的关键。腹腔冲洗细胞学（peritoneal lavage cytology，PLC）检查是目前常规用于腹腔脱落癌细胞检测的方法，但其缺点是对微量癌细胞检测敏感性低，阳性率仅为14％～21％，有较高的漏诊率。胃癌细胞脱落入腹腔后，其在腹腔内的生物学活动导致许多特异性分子的产生，因此能够检测到这些特异性分子的存在就证明了腹腔中肿瘤细胞的存在。有鉴于此，许多国内外学者利用各种分子生物学方法在胃癌患者的腹腔冲洗液中检测胃癌腹膜转移相关的特异性分子，以期提高脱落癌细胞的检出率。研究对象主要集中在肿瘤细胞相关抗原、细胞外基质及相应的降解酶类、粘附分子与细胞因子等。但各种研究结果并不一致，究竟何种分子指标能够切实有效的提高脱落肿瘤细胞的检出率，目前尚无法达成共识。在各种分子生物学检测方法中，RT-PCR方法具有较高的灵敏度，从而使得胃癌腹腔微转移检测成为可能。本研究从上述问题出发，选取与胃癌腹膜转移密切相关的8种分子生物学检测标志物，分别为癌胚抗原（carcinoembryonic antigen，CEA）、肝素酶（heparanase，HPA）、多巴脱羧酶（dopa decarboxylase，DDC）、转化生长因子β1（transforminggrowth factor p1，TGF-p1）、基质金属蛋白酶7（matrix metalloproteinase,7，MMP-7）、细胞角蛋白20（cytokeratin 20，CK20）、碱性成纤维细胞生长因子（basic fibroblast growth factor，bFGF）、磷酸丝氨酸磷脂酶（L-3-phosphoserine phosphatase，L-3-PP），用RT-PCR方法对92例胃癌患者的腹腔冲洗液进行并行检测，对上述标志物进行初步筛选，以期找出提高脱落肿瘤细胞检出率的理想指标，用以进一步指导临床的诊断治疗。材料与方法1、标本采集选取中国医科大学附属第一医院肿瘤外科2005～2006年间胃癌患者的腹腔冲洗液标本92例。腹腔液标本静置5分钟后，以2000 r／min离心10min，取部分沉渣HE染色、细胞学检查；其余沉渣深低温冰箱冻存，用于提取总RNA。胃癌原发病灶的侵袭深度、浆膜类型、大体类型、生长方式等临床病理因素按13版日本胃癌病理规约标准判定。2、提取腹腔冲洗液总RNATRIZOL法提取胃癌腹腔冲洗液沉渣标本中的总RNA。取少量RNA用于含量及纯度测定，其余分装后置-70℃保存。3、RT-PCR扩增各个分子mRNA（1）cDNA第一链合成用反转录试剂盒将总RNA逆转录成cDNA第一链。（2）PCR扩增各个指标cDNA引物序列利用Primer 3.0软件设计，β-actin做内对照。（3）琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物，用安莱图像分析仪扫描和Chemilmager5500软件分析半定量。4、统计学分析实验数据应用软件SPSSll.5分析，选用x²检验和方差分析对数据进行分析。结果1、RT-PCR与PLC检查结果92例胃癌腹腔冲洗液中，CEA mRNA阳性率为65.2％（60／92），HPA mRNA阳性率为58.7％（54／92），DDC mRNA阳性率为62.0％（57／92）；TGF-β1 mRNA阳性率为35.9％（33／92），MMP-7 mRNA阳性率为39.1％（36／92），CK20 mRNA阳性率为42.4％（39／92），bFGF mRNA阳性率为48.9％（45／92），L-3-PP mRNA阳性率为23.9％（22／92）；PLC阳性率为25％（23／92）。而10例良性疾病腹腔冲洗液中均未检测到这8种标志物的mRNA。8种标志物中，CEA mRNA、HPA mRNA、DDC mRNA的阳性率明显高于TGF-β1 mRNA、MMP-7 mRNA、CK20 mRNA、bFGF mRNA和L-3-PP mRNA这5种标志物以及PLC检查（P＜0.05），显示了较好的敏感性。而TGF-β1 mRNA、MMP-7 mRNA、CK20 mRNA、bFGF mRNA、L-3-PP mRNA与PLC检查相比，虽有增高，但无统计学差异（P＞0.05）。在浸润深度为透浆膜层和浆膜层外的21例中，CEA mRNA、HPA mRNA、DDC mRNA的表达阳性率分别为95.2％、90.5％、90.5％；PLC结果阳性的23例中，CEA mRNA、HPA mRNA、DDC mRNA的表达阳性率分别为95.7％、87.0％、91.3％；肉眼腹膜转移阳性的13例中，CEA mRNA、HPA mRNA、DDC mRNA阳性表达的比例分别为100％、92.3％、100％，也显示了较好的敏感性。在浸润深度为粘膜层、粘膜下层和肌层的29例中，CEA mRNA、HPA mRNA、DDC mRNA的表达特异性分别为86.9％、86.9％、93.1％，说明其具有较好的特异性。2、CEA tuRNA、HPA tuRNA、DDC tuRNA的表达与胃癌腹膜转移相关临床病理因素比较胃癌腹腔液中CEA mRNA、HPA mRNA、DDC mRNA表达相对值随着肿瘤浸润深度的增加而显著增加，亦随着浆膜类型的恶变而有显著增加（P＜0.05）。另外CEA mRNA和DDC mRNA的表达还与胃癌生长方式有关，浸润型生长要明显高于限局型生长（P＜0.05）。CEAmRNA的表达还与胃癌的大体类型相关，Borr3+Borr4型要高于Borr1+Borr2型（P＜0.05）。结论（1）RT-PCR作为一种检测胃癌腹腔脱落癌细胞的方法具有较好的灵敏性；（2）CEA、HPA、DDC作为胃癌腹膜转移相关的3种标志物，用于胃癌腹膜转移的预测和腹膜亚临床转移的筛检，具有较好的灵敏性和特异性，优于PLC检查。胃癌是我国人群中发病率和死亡率均占第一位的恶性肿瘤，胃癌的转移是胃癌患者术后死亡的重要原因之一。因此阐明胃癌转移的分子机制并发现新的防治靶点具有重要的理论和实践意义。以往许多研究都表明，肝素酶（heparanase，HPA）和多巴脱羧酶（dopa decarboxylase，DDC）都是胃癌侵袭转移过程中的重要因子，本人的前期实验也发现HPA和DDC与胃癌腹膜转移特异性相关。探讨HPA和DDC在胃癌转移过程中的作用，可以为今后胃癌的基因治疗以及预防转移提供新的靶点。RNA干扰（RNAinterference，RNAi）技术是一种新兴的基因治疗技术，能高效、特异的降解细胞内有关基因的mRNA，具有广阔的应用前景，目前已成为探寻肿瘤相关基因领域的一个重要热点。本研究在体外合成能够特异性抑制HPA和DDC表达的siRNA，分别转染人胃癌细胞株BGC823，用RT-PCR和Western blotting方法检测转染后胃癌细胞HPA和DDC的表达情况，并通过体外侵袭实验观察转染后胃癌细胞侵袭能力的变化，旨在探讨HPA和DDC基因在胃癌侵袭转移中的作用。材料与方法1、细胞培养胃癌细胞BGC823培养于含10％小牛血清、100U／ml青霉素和100ug／ml链霉素的RPMll640培养基，培养条件为37℃、5％CO₂。实验选用对数生长期细胞，通过0.20％胰蛋白酶消化后收集。小鼠成纤维细胞NIH3T3细胞的培养同前。2、小干扰RNA（small interference RNA，siRNA）体外合成用Ambion公司提供的网上在线设计工具进行引物设计。用AmbionSilencerTM siRNA Construction Kit体外合成正义链和反义链RNA并退火形成双链RNA（double strand RNA，dsRNA）。3、siRaNA转染转染前1d，将对数生长期的人胃癌细胞BGC823消化、离心、重悬，4×105／孔接种于6孔板上，第二天当细胞融合达80％左右时进行转染。靶基因siRNA的转染用TransMessenger转染试剂（Qiagen，Chatsworth，CA）。按说明书操作。第4天分析mRNA抑制程度。第8天分析蛋白抑制程度。第9天用Transwell分析细胞侵袭力。4、RNA提取及RT-PCR检测转染胃癌细胞BGC823第4天时，TRIZOL法提取细胞总RNA，反转录成cDNA。PCR产物在1％琼脂糖凝胶中电泳，自动电泳凝胶成像分析系统下成像分析。5、Western blotting检测转染胃癌细胞BGC823第8天时，用0.2％胰蛋白酶消化细胞，加入裂解缓冲液静致10min，4℃12000rpm离心1h，上清为细胞浆蛋白组分；样品（蛋白）浓度的定量；样品调成相同浓度，加入5xSDS凝胶加样缓冲液，沸水煮5min；蛋白电泳40V 90min然后转为80V 120min；转印40V 2h)；TBS浸泡10min；5％脱脂奶粉封闭1h，TTBS洗5min2次；一抗稀释500倍4℃杂交过夜；TTBS洗5min2次；二抗稀释1000倍4℃杂交2h；TTBS洗5min2次，ECL显色；获取图象。6、细胞侵袭力实验转染胃癌细胞BGC823第9天时，用0.2％胰蛋白酶消化、收集，制成单细胞悬液，调整细胞浓度为1×10⁶／ml。将Millicell培养小室放入24孔板中，各取细胞悬液200μl加入Millicell小室，在小室的下室加入400l无血清培养24h的小鼠成纤维细胞NIH3T3细胞上清液，每处理组各设3个复孔。培养8h后取出小室，用棉签擦净小室内的细胞，切取微孔膜，95％酒精固定，苏木素伊红染色。随机于400倍显微镜下取上、下、左、右、中心共5个视野计数穿膜细胞数，取各视野的平均数表示肿瘤细胞的侵袭能力。7、统计学分析利用SPSSll.5软件对组间差异进行方差分析和t检验。结果1、siRNA转染对胃癌细胞BGC823的mRNA表达的影响化学合成的siRNA-HPA与siRNA-DDC分别转染BGC823细胞4天后HPA与DDC基因mRNA表达受到抑制，而未转染组和阴性对照组并未发现HPA与DDC基因表达抑制现象。2、siRNA转染对胃癌细胞BGC823的蛋白表达的影响化学合成的siRNA-HPA与siRNA-DDC分别转染BGC823细胞8天后HPA与DDC基因蛋白表达明显下降，而未转染组和阴性对照组并未发现HPA与DDC蛋白表达抑制现象。3、siRNA转染对胃癌细胞侵袭能力的影响细胞体外侵袭实验显示三组细胞均能穿过附有Matrigel胶的滤膜，但实验组细胞数明显低于未转染组和阴性对照组（P＜0.05），而未转染组和阴性对照组之间细胞数无明显差异，提示分别抑制HPA和DDC基因表达均能显著降低胃癌细胞的侵袭能力。结论（1）用体外合成的siRNA-HPA和siRNA-DDC转染胃癌细胞BGC823可以抑制其HPA和DDC的表达；（2）胃癌细胞BGC823分别转染siRNA-HPA和siRNA-DDC后，HPA和DDC表达下调，其侵袭和转移能力降低。