目前应用寡核苷酸进行基因定点修复的研究已在多系统多水平展开,包括细菌、真菌、植物和动物等.研究人员发现,寡核苷酸的这种作用极不稳定,重复性较差,由于对其作用机制不了解,很难将效率提高到应用水平.因此当务之急是揭示寡核苷酸介导的基因定点修复的作用机制.因此我们设计了哺乳动物细胞定点修复的荧光报告系统.将定点突变的EGFP基因(mEGFP)导入HeLa细胞,G418筛选获得整合有mEGFP基因的HeLa-mEGFP,进而将合成的针对mEGFP点突变的打靶分子(单链DNA寡核苷酸)以脂质体介导的方式转染HeLa-mEGFP细胞,荧光显微镜观察、流式细胞仪分析确定打靶分子的定点修复的效率.实验证明该系统利于快速、准确地测定定点修复事件的发生,结果稳定,重复性好,在此基础上可以深入进行机制研究.在该系统中,寡核苷酸作用还表现出明显的链的偏向性,无论有无thymidine作用,总是针对正义链打靶的分子起效,而与之互补的另一条打靶分子几乎没有修复作用,因此我们也支持Kmiec和Yoon等人提出的SSO作用的转录相关因素.结合该实验所发现的提高效率的复制相关因素,我们认为寡核苷酸的定点修复作用并不是单一的机制,而是包括复制、转录、错配修复等多种因素的共同作用.随着更多的实验研究,寡核苷酸的作用机制将会完整而系统地展现出来.由于该系统有效提高了定点修复的效率(使用胸苷可将效率提高到原先的10倍水平),流式细胞仪检测最高值可达到1.67％.在这一前提下,我们利用AS-PCR、PCR-RFLP、细菌菌落杂交、DNA顺序、以及免疫组化、Western blot等多种检测方法,能够从多水平验证靶位点的特异性改变,均获得了明确的检测结果.