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刺参属温带种类,当海水温度升高到一定范围后,活动降低、摄食停止,进入夏眠。夏眠期间,刺参机体出现器官退化、代谢减退、防御系统调整等一系列生理生化反应。本论文从分子生物学角度出发,研究了刺参夏眠期间器官退化、基因表达调控、表观遗传调控、抗氧化防御酶类基因调控、离子泵蛋白基因调控等过程,初步探讨刺参夏眠期间各项调控的分子机理。主要研究结果如下:1.刺参夏眠期间消化道组织细胞凋亡是其退化的重要原因。采用室内诱导夏眠实验手段,对夏眠过程中退化显著的消化道进行细胞凋亡研究,发现:25°C温度诱导刺参进入夏眠,消化道组织发生萎缩退化;HE切片观察及TUNEL原位检测细胞凋亡实验直观展示了刺参消化道组织退化中的细胞凋亡过程,表明夏眠刺参消化道退化与细胞凋亡相关;凋亡诱导相关因子基因(BAX、CTSD和ACIN1)表达量检测显示:在实验0天时,BAX表达量显著上调,在实验第5、10天时BAX、CTSD和ACIN1表达均显著上调,在实验20、40天时,各基因表达量均明显回落,表明各因子参与凋亡调控。2.夏眠期间刺参基因表达调控明显,参与各项生命活动的非看家基因表达受到广泛抑制。采用Roche 454(GS FLX Titanium System)cDNA高通量测序技术构建了刺参混合组织夏眠转录表达谱数据库,经分析判定质量较高、数据可靠;利用序列去冗、拼接、注释等生物信息学处理方法,共获得279,933条高质量EST数据,拼接获得87,059条Unigene序列(56,416 Contig和30,643 Singlet),其中7,786条Unigene获得注释信息,3,755条Unigene获得GO功能注释;对获得的基因序列库进行GO聚类分析,认为具有结合功能(binding)及催化活性(catalytic activity)的基因、参与生物学调节功能(biological regulation)的基因及细胞外组分(extracellular region)合成的基因在刺参夏眠期间受到表达抑制;对数据库序列进行SSR及SNP位点搜索,获得大量多态性位点。3.夏眠期间刺参表观遗传调控明显,与基因表达抑制调控相关。以454高通量测序构建的转录谱数据为基础,筛选8个表观遗传调控相关修饰因子基因,结合现场调查及室内诱导夏眠实验,检测刺参夏眠过程消化道组织DNA甲基化、染色质重塑、组蛋白乙酰化及组蛋白甲基化调控相关基因表达调控过程。结果显示:刺参夏眠期间,消化道组织DNA甲基化、染色质重塑、组蛋白去乙酰化及组蛋白甲基化调控因子基因表达上调。4.夏眠期间刺参呼吸树抗氧化防御酶类基因表达调控明显。根据基因功能注释,筛选5个抗氧化防御酶类基因,结合现场调查及室内诱导夏眠实验,检测刺参夏眠过程呼吸树组织抗氧化防御酶类基因表达调控过程。研究结果显示:现场调查夏眠刺参呼吸树样品中Cu/Zn-SOD及PRDX5基因表达上调,PRDX6基因表达量基本没有变化,而CAT及PHGPx基因表达量均出现显著下降;室内诱导刺参夏眠过程中,各抗氧化防御酶类均出现基因表达量波动,而在25℃温度条件下40天后各基因表达变化与现场调查实验结果一致。5.夏眠期间刺参消化道离子泵蛋白基因表达较稳定。根据基因功能注释,筛选4个离子泵蛋白基因,结合现场调查及室内诱导夏眠实验,检测刺参夏眠过程消化道离子泵蛋白基因表达调控过程。现场调查实验结果显示,夏眠刺参消化道组织中,V-ATPase, A基因表达量出现显著下调,其他离子泵蛋白基因(Na+/K+ ATPase、SERCA和V-ATPase, B)表达量均保持稳定;室内诱导实验结果与现场调查实验结果一致。