抑制S-腺苷同型半胱氨酸水解酶对糖尿病肾病的影响

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目的:慢性肾脏病(Chronic Kidney Disease,CKD)是临床上不同类型的慢性肾病统称,病程进展隐匿,且具有进行性、不可逆性的特点,因此该疾病严重消耗国家医疗卫生资源,增加社会负担,威胁着人类的身心健康,成为中国、美国甚至全球的重要公共卫生问题。在引起CKD的众多病因中,糖尿病肾病(Diabetic nephropathy,DN)是主要原因。研究发现血浆S-腺苷同型半胱氨酸(S-adenosylhomocysteine,SAH)水平可能比血浆同型半胱氨酸(Hcy)水平能更敏感的预测肾功能不全。S-腺苷蛋氨酸(S-adenosy-l-methionine,SAM)经过甲基转移反应后,产生代谢产物SAH,机体内SAH进一步代谢的关键酶是S-腺苷同型半胱氨酸水解酶(SAH Hydrolase,SAHH),SAHH的活性可以对SAH的水平产生影响。目前SAH水平对1型糖尿病肾病的影响少有研究报道。本研究拟在整体动物和细胞水平,通过ADA抑制SAHH,来探讨SAH水平变化对肾脏损伤的影响及初步机制。方法:体内实验:将80只4-6周龄的正常C57BL/6雄性小鼠置于SPF动物房中饲养,普通饲料喂养,不限制饮水、摄食。动物随机分为四组:正常组、链脲佐霉素(STZ)组、腺苷二醛(ADA)组、ADA+STZ组。STZ组连续五天腹腔注射链脲佐霉素(50mg·kg-1),五天后STZ组停止给药,继续给予溶剂对照,ADA组隔天腹腔注射腺苷二醛(1mg·kg-1),ADA+STZ组以同样的方法进行链脲佐霉素处理的同时,联合隔天腹腔注射腺苷二醛。实验进行8周,使用高效液相色谱-串联质谱法(HPLC-MS/MS)检测血浆SAH水平,血糖试纸法检测血糖,考马斯亮蓝法检测24h尿蛋白含量,制作肾脏石蜡切片后,PAS染色观察肾皮质肾小球的病理变化,通过透射电镜观察肾脏组织超微结构的变化,探讨抑制SAHH对糖尿病肾病的影响。体外实验:人肾足细胞传代培养后,及时制作细胞爬片,根据实验需要将细胞分设为对照组、高糖组、ADA组、高糖+ADA组。高糖组使用20 mmol/L葡萄糖溶液(Glucose solution,GLU)处理诱导足细胞损伤模型,高糖+ADA组同时给予20 mmol/L葡萄糖溶液和20μmol/L腺苷二醛溶液(ADA),各组均处理24h,每组均设置两个复孔。使用Phalloidin染色法,观察不同处理组肌动蛋白的表达程度,用ROS活性氧试剂盒检测细胞内活性氧的产生,TUNEL细胞凋亡试剂盒检测细胞凋亡情况。结果:(1)小鼠血浆SAH水平变化:与对照组SAH浓度(12.26±3.80 nmol·L-1)相比,ADA组(33.77±5.46 nmol·L-1)和STZ+ADA组(35.92±7.10 nmol·L-1)血浆SAH浓度明显升高(P<0.01),对照组和STZ组两组间差异不具有统计学意义;与STZ组(14.34±3.90 nmol·L-1)比较,ADA组和STZ+ADA组血浆SAH浓度显著升高(P<0.01)。(2)小鼠体重变化:经过8周给药,STZ、STZ+ADA组小鼠被毛光泽度下降。与对照组体重(25.769±2.272g)相比,STZ组小鼠体重(18.911±2.374g)、ADA+STZ组小鼠体重(17.922±1.829g)明显下降(P<0.05)。(3)小鼠血糖、尿蛋白含量及肾脏系数变化:与对照组血糖(5.75±1.20mmol·L-1)比较,STZ组血糖(26.60±3.11 mmol·L-1)、STZ+ADA组血糖(26.12±2.45 mmol·L-1)显著升高(P<0.05),ADA组血糖无统计学差异。与对照组比较,STZ组、ADA组24 h尿蛋白均显著升高(P<0.05);与STZ组比较,STZ+ADA组24h尿蛋白有一定程度增加(P<0.05)。与对照组相比,STZ组和STZ+ADA组肾脏系数显著增加(P<0.05);与STZ组比较,STZ+ADA组肾脏系数差异无统计学意义。(4)小鼠肾组织病理学特征的变化:PAS染色结果显示对照组肾小球结构清晰,肾小球基底膜无增厚,系膜基质无增多。与对照组比较,STZ组小鼠肾小球基底膜增厚,系膜基质增多;与STZ组比较,STZ+ADA组PAS染色阳性产物增多(P<0.05)。采用透射电镜检测,结果表明与对照组比较,STZ组、ADA组、STZ+ADA组肾小球基底膜出现不同程度皱褶、增厚,同时出现肾小球系膜基质的增多,足细胞肿胀,足突发生融合;与STZ组比较,STZ+ADA组肾组织病理改变程度加重(P<0.05)。(5)ADA对肾足细胞骨架蛋白F-actin的影响:与对照组相比,高糖组F-actin肌动蛋白骨架出现一定程度解体、塌陷(P<0.05);与高糖组(0.058±0.005)相比,高糖+ADA组平均光密度值(0.056±0.004)稍降低,但不具有统计学差异。(6)ADA对肾足细胞ROS产生的影响:与对照组比较,高糖组细胞内活性氧产生增加(P<0.01);与高糖组比较,ADA组、ADA+STZ组细胞内活性氧明显升高,氧化应激损伤加重(P<0.01)。(7)ADA肾足细胞凋亡的的影响:与对照组比较,高糖组细胞凋亡增加(P<0.01);与高糖组比较,ADA+高糖组细胞凋亡明显增加(P<0.05)。结论:(1)体内动物实验结果表明,ADA(1mg/kg)抑制SAHH,可以在体内诱导SAH水平显著增加,促进肾小球基底膜出现明显增厚,足细胞结构严重破坏,增加尿蛋白的排出,加重肾脏损伤。(2)体外细胞实验结果表明,ADA(20μmol/L)抑制SAHH,增强细胞氧化应激,诱导骨架蛋白结构的紊乱,促进足细胞凋亡。
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