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中东呼吸综合征（Middle East respiratory sydrome,MERS）是由中东呼吸综合征冠状病毒（MERS coronavirus,MERS-CoV）感染引起的具有高病死率特点的一种新发传染性呼吸系统疾病。MERS-CoV具有一定的人与人间传播能力,且至今仍未有消失迹象,这引起了人们对MERS-CoV全球传播的担忧。然而目前对于MERS-CoV仍无有效的疫苗和治疗制剂可用,因此建立快速、简单的MERS-CoV检测方法,进行疫苗定量和该病的早期诊断,对有效预防和控制MERS十分必要。MERS-CoV的刺突糖蛋白（Spike,S）由N端的S1亚基和C端的S2亚基组成。位于S1亚基上的受体结合区域（Receptor Binding Domain,RBD）能通过结合宿主细胞表面DPP4受体来介导病毒的进入,是诱导中和抗体产生的主要区域,因而成为各种候选疫苗和治疗制剂构建的靶标。本研究成功制备四株鼠抗MERS-CoV S-RBD蛋白单克隆抗体,利用偶联有选定单克隆抗体的免疫亲和层析柱和阴离子交换层析柱来纯化出高纯度的MERS-CoV S1蛋白,并建立了定量检测MERS-CoV抗原双抗体夹心ELISA方法。第一章:鼠抗MERS-CoV S-RBD蛋白单克隆抗体（单抗）及免疫亲和层析柱的制备。目的制备鼠抗MERS-CoV S-RBD蛋白单抗,并以此制备出具有特异性的免疫亲和层析柱。方法将四株复苏的抗MERS-CoV S-RBD杂交瘤细胞（1#、3#、5#和13#）注入小鼠腹腔,联合饱和硫酸铵沉淀法和蛋白A柱亲和层析法从获得的腹水中纯化出四株单抗（mAb-1、mAb-3、mAb-5和mAb-13）,利用Western-blot和间接IFA对其进行鉴定;利用间接ELISA挑选出亲和力最高的单抗,偶联至CNBr-activated Bestarose 4B凝胶上制备特异性免疫亲和层析柱。结果Western-blot和间接IFA分别鉴定证明纯化的四株单抗均能特异性结合S-RBD蛋白和S蛋白。经间接ELISA比较,mAb-13亲和力最高。mAb-13的偶联效率高达99.8%。结论成功制备特异性鼠抗MERS-CoV S-RBD蛋白单抗及免疫亲和层析柱,为MERS-CoV快速诊断方法的建立和候选疫苗的纯化奠定了基础。第二章:MERS-CoV S1蛋白的表达、纯化和鉴定。目的表达、纯化并鉴定具有天然构象的MERS-CoV S1蛋白。方法将扩增出的S1基因连接至pFastBac1质粒,构建重组质粒pFB1-S1;将pFB1-S1转化至DH10Bac感受态中,构建重组杆粒BpFB1-S1;将BpFB1-S1转染至sf9细胞,拯救重组杆状病毒rpFB1-S1;将接种rpFB1-S1的sf9细胞悬浮培养上清联合免疫亲和层析法和阴离子交换层析法进行纯化;利用间接IFA、SDS-PAGE、薄层扫描和Western-blot分别鉴定目的蛋白的表达、分子量、纯度和反应原性。结果PCR扩增产物大小为2212bp,pFB1-S1和BpFB1-S1构建均正确;感染rpFB1-S1的sf9细胞出现特异性绿色荧光,感染空杆状病毒rpFB1的sf9细胞未出现荧光;SDS-PAGE凝胶在相对分子质量约100KDa处出现目的蛋白条带,纯度高达95%以上;纯化的目的蛋白能与mAb-13发生特异性结合。结论成功表达、纯化并鉴定MERS-CoV S1蛋白,为MERS-CoV检测方法的建立及候选疫苗和治疗制剂的开发奠定了基础。第三章:定量检测MERS-CoV抗原双抗体夹心ELISA的建立及应用。目的建立定量检测MERS-CoV抗原双抗体夹心ELISA方法,并将其应用于疫苗定量。方法以MERS-CoV S1蛋白为标准品,以mAb-13为捕获抗体,以马抗MERS-VLPs特异性IgG为检测抗体,建立检测MERS-CoV S1蛋白抗原含量的双抗体夹心ELISA,并对其灵敏性、特异性和重复性进行了检测;并将该方法用于MERS病毒样颗粒（MERS-VLPs）、MERS假病毒和表达MERS-CoV S1蛋白的重组狂犬病病毒(rSRV9-MERSS1)中S1蛋白的定量。结果该方法的线性范围为31.21000.0 ng/ml,定量限和检测限分别为31.2 ng/ml和7.8ng/ml,与SARS-CoV S1蛋白不发生特异性反应,批内和批间变异系数均小于10%;该方法检测到含有MERS-VLPs、MERS假病毒(400 TCID50/ml)和rSRV9-MERSS1(2×108TCID50/ml)的上清中S1蛋白浓度分别为186.4 ng/ml、211.9 ng/ml和490.3 ng/ml。结论建立的双抗体夹心ELISA方法的灵敏性、特异性和重复性良好,可用于MERS-CoV S1蛋白抗原的定量检测。